CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Thảo luận chung
Hệ gen virus cúm A/H5N1 là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn mã hóa cho 11 protein, trong đó bao gồm nhóm gen cấu trúc: NP, M và NS thường xảy ra hiện tượng cắt nối exon (splicing) nên mỗi phân đoạn mã hoá cho 2 protein tương ứng là (M1, M2) và (NS1, NS2) [48]. Một đặc điểm quan trọng của virus cúm A/H5N1 là hệ gen ln biến đổi để thích ứng gây bệnh.
Tại Việt Nam, hiện nay bệnh cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 đã xuất hiện các clade mới (clade 2.3.2.1) tạo sự đa dạng và làm phức tạp tình hình dịch tễ
cũng như cơng tác phịng chống. Vì vậy việc nghiên cứu giám sát chặt chẽ sự tiến hoá của hệ gen cũng như các gen của virus cúm A/H5N1 là điều hết sức cần thiết.
Trên cơ sở các kết quả thu nhận được trong nghiên cứu và phân tích trình tự nucleotide và amino acid của các gen cấu trúc, chúng tơi có một số nhận xét như sau:
1. Hai chủng virus cúm A/H5N1 phân lập tại Quảng Trị - Việt Nam năm 2011 giữ nguyên độ dài các gen khung. Phân đoạn 5 chứa gen NP có độ dài 1497 nucleotide mã hoá 468 amino acid. Phân đoạn 7 và 8 xảy ra hiện tượng cắt – nối exon tạo nên các khung đọc mở khác nhau mã hoá cho các chuỗi polypeptide khác nhau. Đây cũng là hiện tượng xảy ra phổ biến ở virus cúm A nói chung và virus cúm A/H5N1 nói riêng. Hiện tượng này có ý nghĩa quan trọng điều hịa biểu hiện gen trong q trình dịch mã, làm giảm kích thước bộ gen virus cũng như là một cơ chế để tạo ra các gen mới.
Phân đoạn 7 chứa gen M1 và gen M2. Gen M1 có độ dài 759 bp (từ nucleotide đầu tiên đến nucleotide 759), mã hóa cho 252 amino acid, khởi đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen M2 có kích thước 294 bp bao gồm 97 amino acid, bắt đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA. Gen M1 và M2 có chung 27 nucleotide đầu 5’ của vùng mã hóa và gen M2 được tạo ra do nối 27 nucleotide này với 267 nucleotide từ vị trí 716 trở về sau cho đến nucleotide 982.
Phân đoạn 8 chứa gen NS1 và gen NS2. Gen NS2 và NS1 có chung 30 nucleotide đầu 5’ của vùng mã hóa. Gen NS1 có độ dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid, khởi đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen NS2 có độ dài 366 bp bao gồm 121 amino acid, bắt đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA và được tạo ra do nối 30 nucleotide này với 336 nucleotide từ vị trí 514 trở về sau cho đến nucleotide 849.
2. Các amino acid S42, R38, K41 trong NS1 và motif ESEV (vị trí 222 – 225) ở đầu C của protein NS1 được cho là có liên quan đến khả năng gây bệnh và
độc lực của virus cúm A/H5N1 cũng đã được phát hiện ở chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603.
3. Phân tích mức độ đồng nhất của từng gen riêng biệt và tỷ lệ tương đồng về amino acid tương ứng giữa chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 với các chủng của Việt Nam và thế giới cho thấy, các gen thuộc nhóm gen khung thu nhận từ chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có tỷ lệ đồng nhất về thành phần nucleotide (98 - 100%) và tương đồng về thành phần amino acid (99 - 100%) so với các chủng A/H5N1có trong Ngân hàng gen ở Việt Nam năm 2012 và năm 2010, 2011 của Trung Quốc.
4. Phân tích mối quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt của toàn bộ hệ gen, chúng tôi nhận thấy chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 tập hợp trong cùng nhóm với chủng virus cúm A/H5N1 phân lập ở Việt Nam năm 2011-2012 và chủng A-Hubei-2010 phân lập ở Hồ Bắc và A Trung Quốc năm 2010. Trong đó chủng tham chiếu là A-Hubei-2010 đã được xác định thuộc clade 2.3.2.1. Điều này chứng tỏ, có thể các gen khung của chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 phân lập tại Quảng Trị - Việt Nam có mối quan hệ gần gũi với chủng A-Hubei-2010 và EVM- Hunan-2011 của Trung Quốc.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
(1) Toàn bộ 3 phân đoạn thuộc nhóm gen cấu trúc gồm phân đoạn 5: gen NP; phân đoạn 7: gen M và phân đoạn 8: gen NS của virus cúm A/H5N1 chủng Dk-VN- QT800 và Dk-VN-QT1603 đã được thu nhận và giải trình tự.
- Phân đoạn 5 chứa gen NP có kích thước 1497 nucleotide mã hố cho chuỗi polypeptide NP gồm 498 amino acid; Phân đoạn gen M có kích thước 998 nucleotide; phân đoạn gen NS có kích thước 875 nucleotide.
- Phân đoạn 7 (gen M) và phân đoạn 8 (gen NS) xảy ra hiện tượng cắt – nối exon (splicing) tạo ra các sản phẩm gen khác nhau. Phân đoạn 7 gồm 2 gen M1 có độ dài 759 nucleotide mã hoá protein M1 gồm 252 amino aicid và gen M2 có độ dài 294 nucleotide mã hoá protein M2 gồm 97 amino acid. Phân đoạn 8 gồm 2 gen NS1 có độ dài 678 nucleotide mã hố protein NS1 gồm 225 amino acid và gen NS2 có độ dài 366 nucleotide mã hố protein NS2 gồm 121 amino acid. Các gen đều khởi đầu bằng bộ mã ATG. Bộ mã kết thúc của các gen NP, M2 và NS2 là TAA. Riêng các gen M1 và NS1 có bộ mã kết thúc là TGA.
(2) Chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có mức độ đồng nhất (về nucleotide) và tương đồng (về amino acid) cao ở tất cả 3 phân đoạn gen với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở Việt Nam năm 2012 và với chủng cúm A/H5N1 phân lập trên người ở Hồ Bắc – Trung Quốc năm 2010.
(3) Phân tích mối quan hệ phả hệ từng gen riêng biệt của toàn bộ hệ gen cho thấy chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 tập hợp trong cùng nhóm với các chủng cúm A/H5N1 phân lập ở Việt Nam năm 2012 và với chủng cúm A/H5N1 phân lập trên người ở Hồ Bắc – Trung Quốc năm 2010.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục giải trình tự tồn bộ hệ gen của các chủng virus cúm A/H5N1 mới xuất hiện trong năm 2012 và những năm tiếp theo, lưu giữ các gen của các chủng phân lập ở các địa phương khác nhau, trên đối tượng các vật chủ khác nhau để trên cơ sở đó giám sát chặt chẽ cũng như có biện pháp phịng chống bệnh cúm gia cầm đạt hiệu quả.
Cần phân tích đặc tính sinh học phân tử nhóm gen kháng nguyên của các chủng mới xuất hiện năm 2012 và những năm tiếp theo để đánh giá mức độ tiến hóa cũng như mối quan hệ về kháng nguyên-miễn dịch của các chủng virus cúm A/H5N1 với các chủng vaccine cũng như tạo được nguồn nguyên liệu chủ động trong việc kiến tạo và sử dụng vaccine tại Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hịa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông
Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trƣơng Nam Hải (2006), "Phân tích mối
tương đồng kháng nguyên và miễn dịch giữa các chủng virus cúm A, các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vacxin cúm A/H5N1", Tạp chí
Cơng nghệ sinh học 4 (3), tr. 1-7.
2. Lê Thanh Hòa (2006), Y-sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học tập 1, tr. 29-48.
3. Lê Thanh Hịa, Nguyễn Thị Bích Nga, Trần Quang Vui, Nguyễn Mạnh Kiên,
Nguyễn Xuân Vũ, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), "Phát hiện chủng
virus cúm A/H5N1 dòng Phúc Kiến gây bệnh trên gia cầm/người tại Việt Nam",
Tập san Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ tư: Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ nông, sinh, y học và công nghiệp thực phẩm (Hà Nội, 16-17/10/2008).
4. Nguyễn Thị Lan Phƣơng, Lê Văn Hiệp (2006), "Nghiên cứu sản xuất
vacxin phòng chống cúm A/H5N1 cho người trên phôi gà từ chủng NIBRG- 14 tại Viện vacxin và sinh phẩm y tế, Nha Trang", Tạp chí Y học dự phịng 16 (5), tr. 5-10.
5. Lƣơng Thị San, Phạm Thị Sửu, Nguyễn Thanh Liêm, Nguyễn Thị Dung, Phạm Phƣơng Mai, Nguyễn Văn Vĩnh Châu, Võ Công Đồng, Lê Thị Quỳnh Mai, Trần Tịnh Hiền, Hoàng Thuỷ Long, Nguyễn Thị Kim Tiến, Menno De Jong, Peter Cheng, Tổ điều tra cúm gia cầm quốc tế của WHO và Jeremy Farra cùng 14 cộng sự (2004), "Cúm gia cầm týp A (H5N1) trên 10 bệnh nhân ở
Việt Nam", Thời sự Y Dược học bộ 9 (2), tr. 67-74.
6. Phạm Văn Ty (2005); Virus học. Nhà xuất bản giáo dục, 334 trang.
7. Cao Thị Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dƣơng (2005), "Đánh giá về độc tính và khả năng lây cho người của virus
cúm A/H5N1 qua các vụ dịch 2004-2005 tại miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen", Tạp chí Y học dự phòng, 15 (6), tr. 5-10.
8. ACIP - Advisory Committee on Immunization Practices (2000),
"Prevention and Control of Influenza", 49 (03), pp. 1-38.
9. Alonso-Caplen F.V., Nemeroff M.E., Qiu Y., and Krug R.M., (1991),
"Nucleocytoplasmic transport: The influenza virus NS1 protein regulates the
transport of spliced NS2 mRNA and its precursor NS1 mRNA", Genes and
Development, 6, pp. 255-267.
10. Baigent S.J., McCauley J.W. (2001), "Glycosylation of haemagglutinin
and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture", Virus Res, 79(1-2), pp. 177-185.
11. Basler C.F. (2007), "Influenza viruses: basic biology and potential drug
targets", Infect Disord Drug Targets, 7(4), pp 282-93. Review.
12. Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W., Subbarao K. (1999), "Characterization of the
surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997-1998", Virology, 254, pp. 115-123.
13. Castrucci M.R., Kawaoka Y. (1993), "Biologic importance of
neuraminidase stalk length in influenza A virus", J Virol, 67, pp. 759-764.
14. Cauthen A.N., Swayne D.E., Schultz-Cherry S., Perdue M.L., Suarez D.L. (2000), "Continued circulation in China of highly pathogenic avian
influenza viruses encoding the hemagglutinin gene associated with the 1997 H5N1 outbreak in poultry and humans", J Virol, 74, pp. 6592-6599.
15. Chen W., Calvo P.A., Malide D., Gibbs J., Schubert U., Bacik I., Basta S., O’Neill R., Schickli J., Palese P., Henklein P., Bennink J.R., Yewdell J.W. (2001), "A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces
cell death", Nat Med, 7(12), pp. 1306-1312.
16. Chen Z. (2004), "Influenza DNA vacxin: an update", Chin. Med. J.
17. Claas E.C., Osterhaus A.D., van Beek R., De Jong J.C., Rimmelzwaan G.F., Senne D.A., Krauss S., Shortridge K.F., Webster R.G. (1998),
"Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian
influenza virus", Lancet, 351, pp. 472-477.
18. Coleman J.R. (2007), "The PB1-F2 protein of Influenza A virus:
increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages", J Virol, 4, pp. 9-11.
19. Davis C.T, Balish A.L, O’Niell E, Nguyen C.V, Cox N.J, Xiyan X, Klimov A, Nguyen T, Donis R.O (2010), "Detection and characterization
of clade 7 high pathogenicity avian influenza H5N1 viruses in chickens seized at ports of entry and live pouly markets in Vietnam", Avian Dis, 54(1 Suppl), pp. 307-312.
20. de Jong M.D, Hien T.T (2006), "Avian influenza A (H5N1)", J Clin Virol,
35(1), pp. 2-13. Review.
21. de Wit E, Fouchier R.A. (2008), Emerging influenza, J Clin Virol, 41(1), pp. 1-6. Review.
22. Doherty P.C., Turner S.J., Webby R.G., Thomas P.G. (2006), "Influenza
and the challenge for immunology", Nat Immunol, 7(5), pp. 449-455. Review.
23. Jackson D., Hossain J. Md., Hickman D., Perez R. D., Lamb A. R. (2008), "A new influenza virus virulence determinant: The NS1 protein four
C-terminal residues modulate pathogenicity", Microbiology, 105(11), pp.
4381–4386.
24. Gambotto A., Barratt-Boyes S.M., de Jong M.D., Neumann G., Kawaoka Y (2008), "Human infection with highly pathogenic H5N1
influenza virus", Lancet, 371(9622), pp. 1464-1475. Review.
25. Garcia-Garcia J., Rodrriguez V.H. and HeARNnder M.A. (1998),
Mexico, Proceedings of the Fourth InteARNtional Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA. Swayne DE. and Slemons RD (eds.)",
U.S. Animal Health Association, pp. 245-252.
26. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y., Ellis T.M., Lim W., Lipatov A.S.,
Chan K.H., Sturm-Ramirez K.M., Cheung C.L., Leung Y.H., Yuen K.Y., Webster R.G., Peiris J.S., (2004), "H5N1 influenza: a protean
pandemic threat", Proc Natl Acad Sci USA, 101(21), pp. 8156-8161.
27. Hayasaka D., Terajima M., Ennis F.A., (2007), "Pathogenses of
respiratory infections with virulent and attenuated vaccinia viruses",
JouARNl Virology, 10, pp. 1186 – 1743.
28. Hayden F.G., Atmar R.L. and Schilling M. (1999), "Use of the selective
oral neuraminidase inhibitor oseltamivir to prevent influenza", N. Engl. J. Med. 341, pp. 1336-1343.
29. Hilleman M.R. (2002), "Realities and enigmas of human viral influenza:
pathogensis, epidemiology and control", Vacxin, 20(25-26), pp. 3068-3087.
30. Hoffmann E., Stech J., Leneva I., Krauss S., Scholtissek C., Chin P.O., Peiris M., Shortridge K.F. and Webster R.G. (2000), "Characterization of
the influenza A gen pool in avian species in southern China: was H6N1 a derivative or a precursor of H5N1", J. Virol, 74, pp. 6309–6315.
31. Horimoto T. and Kawaoka Y., (1995), "Direct reverse transcriptase PCR
to determine virulence potential of influenza A viruses in birds", J. Clin Microbiol, 33(3), pp. 748-751.
32. Horimoto T., Kawaoka Y., (2006), "Strategies for developing vaccines
against H5N1 influenza A viruses", Trends Mol Med, 12(11), pp. 506-514. Review.
33. Hulse-Post D.J., Sturm-Ramirez K.M., Humberd J., Seiler P., Govorkova E.A., Krauss S., Scholtissek C., Puthavathana P., Buranathai C.,Nguyen T.D., Long H.T., Naipospos T.S., Chen H., Ellis T.M., Guan
Y., Peiris J.S., Webster R.G. (2005), "Role of domestic ducks in the
propagation and biological evolution of highly pathogenic H5N1 influenza viruses in Asia", Proc Natl Acad Sci USA, 102(30), pp. 10682-10687.
34. Inglis S.C. and Brown C.M. (1984), "Differences in the Control of virus
mRNA Splicing during Permissive or Abortive Infection with Influenza A (Fowl Plague) Virus", J.gen.Virol, 65, pp. 153-164.
35. Ito T., Couceiro J.N., Kelm S., Baum L.G., Krauss S., Castrucci M.R., Donatelli I., Kida H., Paulson J.C., Webster R.G. and Kawaoka Y. (1998), "Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses
with pandemic potential", J Virol, 72, pp. 7367-7373.
36. Katz J.M. (2003), "The impact of avian influenza viruses on public
health", Avian Dis, 47(Suppl 3), pp. 914-920.
37. Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R.A., Osterhaus A.D., Payungporn S., Theamboonlers A. and Poovorawan Y. (2005), "Characterization of the
hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand", Acta Virol, 49(4), pp. 277-280.
38. Kodihalli S., Goto H., Kobasa D.L., Krauss S., Kawaoka Y. and Webster R.G. (1999), "DNA vacxin encoding hemagglutinin provides
protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice", J. Virol, 73, pp. 2094–2098.
39. Lamb R.A., Lai C.J., and Choppin P.W. (1981), "Sequences of mRNAs
derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: Colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins", Pro. Natl Acad. Sci. USA, 78(7), pp. 4170-4174.
40. Le Q.M, Kiso M, Someya K, Sakai Y.T, Nguyen T.H, Nguyen K.H.L, Pham N.D, Nguyen H.H, Yamada S, Horimoto T, Takada A, Goto H,
Suzuki T, Suzuki Y, Kawaoka Y. (2005), "Isolation of drug-resistant
H5N1 virus", Nature, 437, pp. 11 - 108.
41. Li K.S. (2004), "Gensis of a highly pathogenic and potentially pandemic
H5N1 influenza virus in eastern", Asia Nature, 430, pp. 209-213.
42. Li Z, Jiang Y, Jiao P, Wang A, Zhao F, Tian G, Wang X, Yu K, Bu Z, Chen H. (2006), "The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian
influenza viruses", J Virol, 80, pp. 11115- 11123.
43. Liu M., Wood J.M., Ellis T., Krauss S., Seiler P., Johnson C., Hoffmann E., Humberd J., Hulse D., Zhang Y., Webster R.G. and Perez D.R. (2003), "Preparation of a standardized, efficacious agricultural H5N3 vacxin
by reverse gentics", Virology, 314(2), pp. 580-590.
44. Luke C.J. and Subbarao K. (2006), "Vacxins for pandemic influenza",
Emerg Infect Dis., 12(1), pp. 66-72.
45. Luong G, Palese P (1992), "Genetic analysis of influenza virus", Curr Opinion Gen Develop, 2, pp. 77-81.
46. Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, Webster R (1999), "The surface
glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties", J Virol, 73, pp. 1146-
1155.
47. Minyong Li and Binghe Wang (2007), "Homology modeling and
examination of the effect of the D92E mutation on the H5N1 nonstructural protein", Journal of Molecular Modelling, 13(12), pp. 1237- 1244.
48. Murphy B.R, Buckler-White A.J, London W.T, Snyder M.H. (1989),
"Characterization of the M protein and nucleoprotein genes of an avian
influenza A virus which are involved in host range restriction in monkeys",
Vaccine, 7, pp. 557–561.
49. Murphy, B.R. and Webster, R.G. (1996), "Orthomyxoviruses. In: Fields
Philadelphia, pp. 1353-1445.
50. Nayak D., Hui E., Barman S. (2004), "Assembly and budding of influenza