Phân tích ge nM

CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của

3.2.2. Phân tích ge nM

3.2.2.1. Phân tích thành phần nucleotide và amino acid

Tồn bộ gen M thu nhận từ chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có kích thước 998 bp, mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide M1 và M2 Gen M1 có độ dài 759 bp (từ trình tự nucleotide đầu tiên đến vị trí nucleotide 759), mã hóa cho 252 amino acid, khởi đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen M2 có kích thước 294 bp bao gồm 97 amino acid, bắt đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA. Gen M1 và M2 có chung 27 trình tự nucleotide đầu 5’ của vùng mã hóa và gen M2 được tạo ra do quá trình ghép nối (splicing) của 27 nucleotide này với 267 nucleotide từ vị trí 716 cho đến vị trí nucleotide 982 (Hình 3.5, phụ lục 1.B).

Trình tự nucleotide gen M1 và M2 của hai chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN- QT1603 được so sánh, phân tích với 20 chủng A/H5N1 của Việt Nam và thế giới của các tác giả khác nghiên cứu qua các năm 2005-2012. Bảng 3.4 liệt kê danh sách các chủng được lựa chọn so sánh.

Những sai khác lớn về nucleotide và amino acid của 2 chủng nghiên cứu với 20 chủng lựa chọn so sánh được thể hiện ở bảng 3.5. Kết quả phân tích cho thấy:

- Gen M1 của chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có 66 vị trí nucleotide sai khác với các chủng so sánh, sự sai khác này dẫn tới 7 vị trí amino acid sai khác (phụ lục 2.B).

Các vị trí sai khác lớn về nucleotide được liệt kê ở Bảng 3.4, trong đó: Có 1 vị trí sai khác hồn tồn giữa 2 chủng nghiên cứu so với các chủng so sánh tại vị trí 630 (A↔G). 9 vị trí sai khác lớn giữa 2 chủng nghiên cứu so với các chủng so sánh, cụ thể: (A↔G) tại vị trí 48, 189, 285, 333, 584, 600; (A↔C) tại vị trí 93, 727; (T↔C) tại vị trí 45, 345, 354, 450, 618, (A↔T) tại vị trí 264.

Có 1 vị trí sai khác hồn tồn giữa chủng Dk-VN-QT800 so với các chủng so sánh cịn lại, đó là: (A↔G) tại vị trí 411; Có 3 vị trí sai khác hồn tồn giữa chủng Dk-VN-QT1603 so với các chủng so sánh là: (C↔G) tại vị trí 19 và (C↔T) tại vị trí 378, 542.

Bảng 3.4. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng

gen M trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.

TT Ký hiệu chủng Loài mắc Năm

phân lập

Nƣớc phân lập Số đăng ký

Ngân hàng gen

1 Dk-VN-QT800* Vịt 2011 Quảng Trị, Việt Nam Đang đăng kí

2 Dk-VN-QT1603* Vịt 2011 Quảng Trị, Việt Nam Đang đăng kí

3 Md-VN-LBM113-2012 Ngan 2012 Việt Nam AB742258

4 Md-VN-LBM132-2012 Ngan 2012 Việt Nam AB742266

5 EVM-Hunan-3-2011 Môi trường 2011 Hồ Bắc, Trung Quốc JX576787

6 Eurasian-eagle-owl-KP-Q133 Cú 2011 Hồng Kông JN808066

7 A-Hubei-1-2010 Người 2010 Trung Quốc CY098761

8 Ck-Jiangsu-k0402-2010 Gà 2010 Trung Quốc JQ638675

9 Dk-Hokkaido-WZ83-2010 Vịt 2010 Nhật Bản AB612904

10 Dk-Hokkaido-WZ101-2010 Vịt 2010 Nhật Bản AB612912

11 Water-Hunan-2009 Nước 2009 Hồ Bắc, Trung Quốc CY098856

12 Great-crested-grebe-Qinghai-2009 Chim lặn 2009 Trung Quốc CY063321

13 Water-Hebei-2009 Nước 2009 Trung Quốc CY098777

14 Water-Xinjiang-2009 Nước 2009 Trung Quốc CY098833

15 Ck-Hunan-2008 Gà 2008 Trung Quốc GU182162

16 Black-crowned-heron-HK-659-2008 Chim vạc 2008 Hồng Kông CY036232 17 Grey-heron-HK-1046-2008 Chim diệc xám 2008 Hồng Kông CY036248

18 Little-egret-HK-8863-2007 Cò 2007 Hồng Kông CY036208

19 A-VN-HN31388M1-2007 Người 2007 Việt Nam HM114588

20 A-VN-UT31239-2007 Người 2007 Việt Nam HM114556

21 Md-Vietnam-1455-2006 Ngan 2006 Việt Nam CY029538

22 Dk-VN-208-2005 Vịt 2005 Việt Nam EU930941

Ghi chú: (*) ký hiệu các chủng trong nghiên cứu

Gen M1 của chủng Dk-VN-QT800có tất cả 66 sai khác về nucleotide với các chủng so sánh. Tuy nhiên sự sai khác về nucleotide này gần như không dẫn đến sự thay đổi về amino acid trong chuỗi trình tự polypeptide M1. Trong khi đó sự sai khác hoàn toàn về nucleotide giữa chủng Dk-VN-QT1603 so với các chủng so sánh còn lại ở vị trị nucleotide 19 và 542 đã dẫn đến sai khác hoàn toàn về amino acid trong chuỗi polypeptide M1 tại vị trí amino acid 7 (LV) và 181 (PL).

Gen M2 của chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có tổng cộng 17 nucleotide sai khác so với các chủng so sánh (phụ lục 2.C).

Bảng 3.5. Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen M1 và M2 chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 so với 20 chủng virus

cúm khác.

Chủng

M1 M2

Các vị trí sai khác nucleotide thay đổi Vị trí có

aa Các vị trí sai khác nucleotide Vị trí có thay đổi amino acid 19 45 48 93 189 264 285 333 345 354 378 387 411 450 468 542 588 600 618 630 727 7 181 19 39 207 245 7 13 82 1 G C A A A A G A T T T T A C T T T A C A A V L G A G A V K N 2 C C A A A A G A T T C T G C T C T A C A A L P C A G A L K N 3 G C A A A A G A C T T T G C T T T A C G A V L G A G A V K N 4 G C A A A A G A C T T T G C T T T A C G A V L G A G A V K N 5 G C A A A A G A T T T T G C T T T A C G A V L G A G A V K N 6 G T G C G T A G C C T C G T C T C G T G C V L G C T G V N S 7 G C A A A A G A C T T T G C T T T A C G A V L G A G A V K N 8 G T G C G T A G C C T C G T C T C G T G C V L G C T G V N S 9 G T G C G T A G C C T C G T C T C G T G C V L G C T G V N S 10 G T G C G T A G C C T C G T C T C G T G C V L G C T G V N S 11 G T G C G T G G C C T T G T C T C G T G C V L G C T G V N S 12 G T G C G T A G C C T C G T C T C G T G C V L G C T G V N S 13 G C G C A A G G C C T T G T T T C G T G C V L G C T A V N N 14 G C G C A A G G T C T T G T T T C G T G C V L G C T G V N S 15 G C G C A A G G T C T T G T T T C G T G C V L G C G G V N S 16 G C G C A A G G T C T T G T T T C G T G C V L G C T G V N S 17 G C A C A A G A C T T T G T T T T A C G C V L G C T G V N S 18 G C G C G T G G C C T T G T C T C G T G C V L G C T G V N S 19 G C A C A A G G C C T T G T T T C G T G C V L G C T G V N S 20 G C A C A A G G C C T T G T T T C G T G C V L G C T G V N S 21 G C G C A G G G C C T T G T T T T G T G C V L G C T G V N S 22 G C G C A A G G C C T T G T T T C G T G C V L G C T G V N S

Chủng Dk-VN-QT1603 cùng thu nhận với chủng Dk-VN-QT800 nhưng có một số vị trí khác biệt ở trình tự nucleotide so với các chủng so sánh đó là: vị trí 19 (G→C); 378 (T→C) và vị trí 542 (T→C) (Bảng 3.5).

Các sai khác này dẫn đến thay đổi thành phần amino acid tổng cộng ở 12 vị trí trong chuỗi polypeptide M2 (Phụ lục 2.C). Trong số các sai khác về nucleotide gen M2 của chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 có 3 nucleotide (vị trí 39, 207, 245) sai khác với hầu hết các chủng so sánh. Nhưng chỉ có 2 sai khác nucleotide ở vị trí 29 và 245 mới dẫn đến thay đổi thành phần amino acid tương ứng của 2 chủng nghiên cứu với hầu hết các chủng so sánh ở các vị trí 13 (K↔L) và 82 (N↔S) (Bảng 3.5 ).

Một điều cần quan tâm xem xét là, protein M2 là một protein có liên quan đến tính kháng amantadine của virus. Chỉ cần thay thế một amino acid ở các vị trí 26 (L→F), 27 (V→A hoặc T), 30 (A→T hoặc V) và 31 (S→N hoặc R) trong vùng xuyên màng của protein M2 có thể làm cho virus có khả năng kháng thuốc [68].

Các vị trí này trong protein M2 của chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 lần lượt là I26, V27, A30 và N31 (Phụ lục 2.C). Đặc biệt là đã có đột biến ở vị trí 31 (S→N) trong protein M2 của chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 mà đột biến này có liên quan đến tính kháng với amantadine.

3.2.2.2. Phân tích sự đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid

Trình tự nucleotide gen M1 và M2 của chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN- QT1603 sau khi giải trình tự thu các chuỗi đã được xử lý và đưa vào chương trình GeneDoc2.5 để phân tích, so sánh sự đồng nhất về thành phần nucleotide và tương đồng về amino acid.

Kết quả phân tích cho thấy:

- Gen M1 của cả 2 chủng Dk-VN-QT800 và chủng Dk-VN-QT1603 có tỷ lệ đồng nhất và tương đồng với các chủng so sánh qua các năm 2005-20012 từ 96 - 99% về trình tự nucleotide và 99 - 100% về amino acid; so với các chủng khác của Việt Nam và một số chủng của thế giới (Trung Quốc, Hồng Kong, Nhật Bản) thì

- Như vậy, khi so sánh giữa các chủng Việt Nam với nhau, tỷ lệ đồng nhất và tỷ lệ tương đồng của gen M1 có biến động không lớn, 96-99% về thành phần nucleotide và 98-100% về thành phần amino acid.

- So sánh giữa các chủng Việt Nam với các chủng của thế giới, mức độ đồng nhất và tương đồng của gen M1 cũng trong khoảng 96-100% về nucleotide và 98- 100% về amino acid (Bảng 3.6).

- Đối với gen M2, tỷ lệ đồng nhất và tương đồng của chủng Dk-VN-QT1603 với các chủng so sánh biên độ lớn hơn của chủng Dk-VN-QT800 (Bảng 3.7). Cụ thể tỷ lệ đồng nhất về thành phần nucleotide của chủng Dk-VN-QT800và của chủng Dk- VN-QT1603 với các chủng so sánh tương ứng là 96 - 100% và 97 - 100%, về tương đồng amino acid là 96 - 100% và 94 - 98%. Trong đó tỷ lệ đồng nhất về thành phần nucleotide và tương đồng về amino acid của cả 2 chủng nghiên cứu với các chủng Việt Nam lựa chọn so sánh qua các năm 2011 và 2012 rất cao 99 - 100% (về thành phần nucleotide) và 98 - 100% (về amino acid). Đối với các chủng Việt Nam lựa chọn so sánh qua các năm 2005 - 2007 thì tỷ lệ là 96 - 98% về thành phần nucleotide và 95 - 97% về tương đồng amino acid.

- So sánh giữa các chủng Việt Nam với nhau, tỷ lệ đồng nhất và tỷ lệ tương đồng của gen M2 là 96 - 100% về nucleotide và và 95 - 100% về amino acid. So sánh giữa các chủng Việt Nam với các chủng của thế giới, tỷ lệ đồng nhất và tương đồng là 97 - 100% về thành phần nucleotide và 94 - 100% về thành phần amino acid.

Bảng 3.6. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen M1 giữa các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 99 99 99 99 96 99 96 96 96 96 97 97 98 97 98 99 97 97 98 97 97 2 99 98 98 99 96 98 96 96 96 96 97 97 98 97 98 99 97 97 97 96 97 3 99 98 99 98 96 98 96 96 96 96 97 97 98 97 98 99 97 97 98 97 97 4 99 98 100 99 96 99 96 96 96 96 97 97 98 97 98 99 97 97 98 97 97 5 100 99 99 99 96 98 96 96 96 96 97 97 98 97 98 99 97 97 97 97 97 6 100 99 99 99 100 96 99 99 99 98 98 97 98 97 98 97 97 97 98 96 97 7 99 98 98 98 99 99 96 96 96 96 97 97 98 97 98 99 97 97 97 96 97 8 99 98 99 99 99 99 98 98 98 99 98 97 98 97 98 97 97 97 98 96 97 9 99 98 99 99 99 99 98 99 99 98 98 97 97 97 97 97 97 97 98 96 97 10 100 99 99 99 100 100 99 99 99 98 98 97 98 97 98 97 97 97 98 96 97 11 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 98 97 98 97 98 97 97 97 98 96 97 12 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 97 98 98 98 98 98 98 98 97 98 13 99 98 100 100 99 99 98 99 99 99 99 99 98 98 98 98 98 98 98 98 98 14 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 99 100 99 98 99 98 98 99 15 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 99 98 98 98 98 97 98 16 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 100 99 98 99 99 98 99 17 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 100 100 98 98 98 97 98 18 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 100 100 100 99 98 98 99 19 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 100 100 100 100 98 98 99 20 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 98 99 21 100 99 99 99 100 100 99 99 99 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 98 22 99 98 99 99 99 99 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99

Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-2011: 6. Eurasian-eagle-owl-KP-Q133: 7. A-Hubei-1-2010: 8. Ck-Jiangsu-k0402-2010: 9. Dk-Hokkaido-WZ83-2010: 10. Dk-Hokkaido-WZ101-2010: 11. Water-Hunan-2009: 12 Great-crested-grebe-Qinghai-2009.: 13. Water-Hebei-2009: 14. Water-Xinjiang-2009: 15. Ck-Hunan-2008: 16. Black-crowned-heron-HK-659-2008: 17. Grey-heron-HK-1046-2008: 18. Little-egret-HK-8863-2007:

Bảng 3.7. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen M2 giữa các

chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.

TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 99 100 100 100 98 99 98 98 98 97 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 96 2 98 99 99 99 97 99 98 97 97 97 97 97 98 98 98 98 97 98 98 98 98 3 100 98 100 100 98 99 98 98 98 97 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 98 4 100 98 100 100 98 99 98 98 98 97 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 98 5 100 98 100 100 98 99 98 98 98 97 98 98 98 99 98 98 98 98 98 98 98 6 96 95 96 96 96 97 99 100 100 98 98 97 99 98 98 98 98 98 99 99 99 7 98 97 98 98 98 95 98 97 97 97 97 97 98 98 98 98 97 98 98 98 98 8 97 96 97 97 97 98 96 99 99 99 98 98 99 99 99 99 98 99 99 99 99 9 96 95 96 96 96 100 95 98 100 98 98 97 99 98 98 98 98 98 99 99 99 10 96 85 96 96 96 100 95 98 100 98 98 97 99 98 98 98 98 98 99 99 99 11 95 94 95 95 95 96 94 97 96 96 98 97 98 98 98 98 98 98 98 98 98 12 96 95 96 96 96 97 95 98 97 97 96 97 99 98 98 98 98 98 99 99 99 13 96 95 96 96 96 95 95 96 95 95 94 95 98 98 98 98 97 98 98 98 98 14 97 96 97 97 97 98 96 100 98 98 97 98 96 99 99 99 99 99 100 100 100 15 97 96 97 97 97 98 96 100 98 98 97 98 96 100 99 99 98 99 99 99 99 16 96 95 96 96 96 97 95 98 97 97 96 97 95 98 98 99 98 99 99 99 99 17 96 95 96 96 96 97 95 98 97 97 96 97 95 98 98 97 98 99 99 99 99 18 96 95 96 96 96 97 95 98 97 97 98 97 95 98 98 97 97 99 99 99 99 19 97 96 97 97 97 98 96 100 98 98 97 98 96 100 100 98 98 98 99 99 99 20 97 96 97 97 97 98 96 100 98 98 97 98 96 100 100 98 98 98 100 100 100 21 97 96 97 97 97 98 96 100 98 98 97 98 96 100 100 98 98 98 100 100 100 22 97 96 97 97 97 98 96 100 98 98 97 98 96 100 100 98 98 98 100 100 100

Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-2011: 6. Eurasian-eagle-owl-KP-Q133: 7. A-Hubei-1-2010: 8. Ck-Jiangsu-k0402-2010: 9. Dk-Hokkaido-WZ83-2010: 10. Dk-Hokkaido-WZ101-2010: 11. Water-Hunan-2009: 12 Great-crested-grebe-Qinghai-2009.: 13. Water-Hebei-2009: 14. Water-Xinjiang-2009: 15. Ck-Hunan-2008: 16. Black-crowned-heron-HK-659-2008: 17. Grey-heron-HK-1046-2008: 18. Little-egret-HK-8863-2007:

DK-VN-QT800-2011 DK-VN-QT1603-2011 EVM-Hunan-3-2011-JX576787-M1 A-Hubei-1-2010-CY098761 Md-VN-LBM113-2012-AB742258 Md-VN-LBM132-2012-AB742266-M1 Grey-heron-HK-1046-2008-CY036248 Water-Xinjiang-2009-CY098833 Ck-Hunan-2008-GU182162 Black-crowned-heron-HK-659-2008-CY036232 Dk-VN-208-2005-EU930941 Water-Hebei-2009-CY098777 Md-VN-1455-2006-CY029538 A-VN-HN31388-2007-HM114588 A-VN-UT31239-2007-HM114556 Little-egret-HK-8863-2007-CY036208 Water-Hunan-7-2009- CY098856-M1 Ck-Jiangsu-k0402-2010-JQ638675 Great-crested-grebe-Qinghai-2009-CY06332 Eurasian-eagle-owl-HK-Q133-2011-JN808066 Dk-Hokkaido-WZ83-2010-AB612904