CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.2. Phân tích so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của
3.2.3. Phân tích gen NS
3.2.3.1. Phân tích trình tự nucleotide và amino acid
Gen NS thu nhận từ chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 mã hoá cho 2 chuỗi polypeptide NS1 và NS2 (Hình 3.6). Gen NS1 có độ dài 678 bp, mã hóa cho 225 amino acid, khởi đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TGA. Gen NS2 có độ dài 366 bp bao gồm 121 amino acid, bắt đầu bằng bộ mã ATG và kết thúc bằng bộ mã TAA. Gen NS2 và NS1 có chung 30 nucleotide đầu 5’ của vùng mã hóa và gen NS2 được tạo ra do ghép nối 30 nucleotide này với 336 nucleotide từ vị trí 514 trở về sau cho đến nucleotide 849. Phần mã hóa này tạo ra một khung đọc khác, lệch một nucleotide so với khung đọc của gen NS1.
Trình tự nucleotide của gen NS1 và NS2 của chủng Dk-VN-QT800và Dk- VN-QT1603 sau đó được so sánh với các chuỗi gen tương ứng của 20 chủng A/H5N1 phân lập tại Việt Nam và thế giới qua các năm 2005-2012 (Bảng 3.7).
Gen NS1 của chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 có 77 vị trí nucleotide sai khác với các chủng so sánh (phụ lục 2.D). Trong đó:
- Có 14 vị trí sai khác lớn giữa 2 chủng nghiên cứu với 20 chủng được lựa chọn so sánh (phụ lục 2D). Sự sai khác này dẫn đến sự thay đổi tại 8 amino acid trong trình tự chuỗi polypeptide NS, cụ thể: (D↔E) tại vị trí 70, (V↔A) tại vị trí 107, (M↔I) tại vị trí 118, (V↔I) tại vị trí 123, (S↔P) tại vị trí 162, (R↔S) (R↔D) tại vị trí 166, (I↔V) tại vị trí 189, (G↔D) tại vị trí 204. Đặc biệt sự sai khác hồn tồn nucleotide ở vị trí 484 (T↔C) giữa 2 chủng nghiên cứu so với 20 chủng còn lại đã dẫn tới sự thay đổi về amino acid ở vị trí 162 trong chuỗi polypeptide NS1.
Bảng 3.8. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới được sử dụng
gen NS trong phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.
TT Ký hiệu chủng Loài mắc Năm phân lập Nƣớc phân lập Số đăng ký Ngân hàng gen
1 Dk-VN-QT800-2011* Vịt 2011 Quảng Trị, Việt Nam Đang đăng kí
2 Dk-VN-QT800-2011* Vịt 2011 Quảng Trị, Việt Nam Đang đăng kí
3 Md-VN-LBM113-2012 Ngan 2012 Việt Nam AB742259
4 Md-VN-LBM132-2012 Ngan 2012 Việt Nam AB742267
5 EVM-Hunan-3-2011 Môi trường 2011 Trung Quốc JX576790
6 Eurasian-eagle-owl-KP-Q133-2011 Cò 2011 Hồng Kông JN808066
7 A-Hubei-1-2010 Người 2010 Trung Quốc CY098762
8 Ck-Jiangsu-k0402-2010 Gà 2010 Trung Quốc JQ638681
9 Dk-Hokkaido-WZ83-2010 Vịt 2010 Nhật Bản AB612905
10 Dk-Hokkaido-WZ101-2010 Vịt 2010 Nhật Bản AB612913
11 Great-crested-Qinghai-1-2009 Chim lặn 2009 Trung Quốc CY063322
12 Water-Hunan-7-2009 Nước 2009 Trung Quốc CY098857
13 Water-Hebei-2-2009 Nước 2009 Trung Quốc CY098778
14 Water-Xinjiang-2009 Nước 2009 Trung Quốc CY098834
15 Grey-heron-HK-1046-2008 Diệc xám 2008 Hồng Kông CY036249
16 Black-crowned-heron-HK-659-2008 Vạc 2008 Hồng Kông CY03623
17 Ck-Hunan-2008 Gà 2008 Trung Quốc GU182161
18 Little-egret-HK-8863-2007 Cị 2007 Hồng Kơng CY036209
19 A-VN-HN31388M1-2007 Người 2007 Việt Nam HM114589
20 A-VN-UT31239-2007 Người 2007 Việt Nam HM114557
21 Md-Vietnam-1455-2006- Ngan 2006 Việt Nam CY029539
22 Dk-VN-208-2005 Vịt 2005 Việt Nam EU930944
Ghi chú: (*) ký hiệu các chủng trong nghiên cứu
- Có 2 vị trí nucleotide sai biệt giữa chủng Dk-VN-QT1603 so với chủng nghiên cứu Dk-VN-QT800và 20 chủng so sánh còn lại, (G↔A) tại vị trí 303, (C↔T) tại vị trí 335. Sự sai khác này dẫn tới sự thay đổi amino acid ở vị trí dịch mã tương ứng trong trình tự chuỗi polypeptide NS1, cụ thể R103K, T112.
Phân tích gen NS2 chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 cho thấy có 39 vị trí nucleotide sai khác với các chủng so sánh (Phụ lục 2.E), trong đó có 5 vị trí sai khác, cụ thể (G↔T) tại vị trí 41, (A↔C) tại vị trí 105, (A↔G) tại vị trí 108, 215 (Bảng 3.6) nhưng chỉ có 3 vị trí sai khác lớn dẫn đến thay đổi 3 amino acid tương ứng trong chuỗi polypeptide NS2 là (G↔V) tại vị trí 14, (L↔F) tại vị trí 35, (R↔K) tại vị trí 72.
Bảng 3.9. Vị trí sai khác nucleotide và amino acid của gen NS1 và NS2 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 so với 20 chủng virus cúm khác. Chủng NS1 NS2 NC AA NC AA 42 183 210 288 308 320 335 354 367 405 484 496 498 562 565 672 70 103 107 112 118 123 162 166 189 204 41 105 108 215 297 14 35 72 1 C G T T A T T G G A T A G A A G D K V I M V S R I G G A A G C G L R 2 C G T T G T C G G A T A G A A G D R V T M V S R I G G A A G C G L R 3 C G T T A T T G G A C A G A A G D K V I M V P R I G G A A G C G L R 4 C G T T A T T G G A C A G A A G D K V I M V P R I G G A A G C G L R 5 C G T C A T T G G A C A G A A G D K V I M V P R I G G A A G C G L R 6 T G T T A T T G G A C A T A G A D K V I M V P S V G T A G A T V L K 7 C G T C A T T G G A C A G A A A D K V I M V P R I G G A A A C G L K 8 T G T C A T T G G A C A T A G A D K V I M V P S V G T A G A T V L K 9 T G T C A T T G G A C A T A G A D K V I M V P S V G T A G A T V L K 10 T G T C A T T G G A C A T A G A D K V I M V P S V G T A G A T V L K 11 T G T C A T T G G A C A T A G A D K V I M V P S V G T A G A T V L K 12 T G T C A T T G G A C A T A G A D K V I M V P S V G T A G A T V L K 13 T G G C A C T A A G C G T C G A E K A I I I P G V D T C G A T V F K 14 T A G C A C T A A A C A T C G A E K A I I I P S V D T C G A T V F K 15 T A T C A T T A A G C G T C G A D K V I I I P S V G T C G A T V F K 16 T A T C A T T A A G C A T C G A D K V I I I P S V G T C G A T V F K 17 T A G C A C T A A G C G T C G A E K A I I I P G V G T C G A T V F K 18 T G T C A T T A A G C A T A G A D K V I I I P S V G T C G A T V F K 19 T A G C A C T A A G C G T C G A E K A I I I P G V D T C G A T V F K 20 T A G C A C T A A G C G T C G A E K A I I I P G V D T A G A T V L K 21 C G G C A C T A A G C G T C G A E K A I I I P D V N T C G A T M F K 22 T A G C A C T A A G C G T C G A E K A I I I P G V D T C G A T V F K
Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-2011: 6. Eurasian-eagle-owl-KP-Q133: 7. A-Hubei-1-2010:8. Ck-Jiangsu-k0402-2010: 9. Dk-Hokkaido-WZ83-2010: 10. Dk-Hokkaido-WZ101-2010: 11. Great-crested-grebe-Qinghai-2009: 12. Water-Hunan-2009: 14. Water-Hebei-2009: 14. Water-Xinjiang-2009:15. Grey-heron-HK-1046-2008: 16. Black-crowned-heron-HK-659-2008: 17. Ck-Hunan-2008: 18. Little-egret-HK-8863-2007:
Vị trí glutamic acid (E) ở vị trí 92 trong protein NS1 cịn liên quan đến khả năng của virus A/H5N1 điều chỉnh đáp ứng với cytokine và tính độc lực cao của virus trên lợn (Seo và cộng sự, 2002). Vị trí của amino acid E92 cũng được phát hiện trong thành phần protein NS1 của chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN- QT1603 (Hình 3.12, bơi đậm và gạch dưới). Chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN- QT1603 trong nghiên cứu cũng có amino acid serin ở vị trí 42 (S42) trong protein NS1 (Hình 3.12, bơi đậm và gạch dưới). Cấu trúc 4 amino acid ở đầu C của protein NS1 là vùng liên quan đến độc lực của virus. Các chủng virus cúm A/H5N1 gây dịch cúm gia cầm với tỷ lệ chết cao gần đây đều có các amino acid
ở đầu C trong NS1 có cấu trúc là ESEV hoặc EPEV [82]. Protein suy diễn của
chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 ở đầu C của protein NS1 cũng có motif là ESEV tại vị trí amino acid 222 -225 (Hình 3.7, phụ lục 3).
Các vị trí amino acid R38 (arginin), K41 (lysin) và A149 (alanin) trong
protein NS1 được cho là liên quan đến khả năng của virus ức chế tế bào sản xuất interferon và kháng lại đáp ứng của chúng [41]. Arginin (R) ở vị trí 38 và lysin (K) ở vị trí 41 cũng đã được phát hiện trong thành phần amino acid của protein NS1 chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 (Hình 3.7). Tuy nhiên, khơng phát hiện amino acid alanin (A) ở vị trí 149 trong protein NS1 của chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603, thay vào đó là amino acid glycin (G) (Hình 3.7, bơi đậm, đóng khung).
Ngồi ra, tryptophan (W) ở vị trí 78 (W78) của protein NS2 liên quan đến sự tương tác giữa NS2 và M1 để vận chuyển ribonucleoprotein của virus ra khỏi
nhân tế bào nhiễm cũng được phát hiện trong 2 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-
QT1603 (Hình 3.7, bơi đậm và gạch dưới).
3.2.3.2. Phân tích sự đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid
Trình tự nucleotide gen NS1 và NS2 chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN- QT1603 và 20 chủng so sánh đã được sử dụng để phân tích sự đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid (Bảng 3.7, Bảng 3.8).
Kết quả phân tích cho thấy:
Đối với gen NS1 (Bảng 3.10)
- Chủng Dk-VN-QT800 và Dk-VN-QT1603 có tỷ lệ đồng nhất và tương đồng với các chủng so sánh qua các năm 2005-2012 có sự biến động 92 - 99% về thành phần nucleotide và 90 - 99% về thành phần amino acid; so với các chủng khác của Việt Nam tỷ lệ này là 92 - 99% và 90 - 99%; so với các chủng của thế giới các tỷ lệ tương ứng là 96 - 98% và 93 - 99%.
- Tỷ lệ đồng nhất và tỷ lệ tương đồng của 2 chủng nghiên cứu so với các chủng phân lập ở Việt Nam năm 2005-2007 là 92 - 97% về thành phần nucleotide, 90 - 97% về thành phần amino acid thấp hơn so với của các chủng phân lập ở Việt Nam năm 2011-2012 tương ứng là 98 - 99% về trình tự nucleotide và 97 - 99% về amino acid.
Đối với gen NS2 (Bảng 3.11)
- Các chủng có tỷ lệ đồng nhất về nucleotide là 93 - 100% và tương đồng về amino acid với các chủng so sánh từ năm 2005 tới năm 2012 biến động khá lớn 89 - 100%.
- Tỷ lệ đồng nhất về trình tự nucleotide của 2 chủng nghiên cứu với các chủng so sánh qua các năm 2010 - 2012 là 98 - 100% về nucleotide và 98 - 100% ; tương đồng về amino acid giữa 2 chủng nghiên cứu với các chủng so sánh các năm 2005 - 2009, tương ứng là 93 - 98% và 89 - 98%. Đặc biệt tỷ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid lên tới 100% so với các chủng phân lập tại Việt Nam năm 2012.
Nhìn chung, tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid của chủng Dk-VN-QT800và Dk-VN-QT1603 là khá cao so với một số chủng phân lập qua các năm 2010 - 2012, nhưng có biến động lớn hơn so với một số chủng phân lập qua các năm 2005 – 2009.
Bảng 3.10. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen NS1 giữa
một số chủng chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 99 99 99 99 98 99 98 98 98 98 99 96 97 97 97 97 96 96 98 92 97 2 99 98 98 99 98 99 98 98 98 98 98 96 97 97 97 97 96 96 98 92 97 3 98 97 99 98 98 99 98 98 98 98 98 95 97 97 97 97 96 96 98 92 96 4 98 97 99 98 98 99 98 98 98 98 98 95 97 97 97 97 96 96 98 92 96 5 99 98 98 98 98 99 98 98 98 98 98 96 97 97 97 97 96 96 98 92 97 6 98 97 98 98 98 98 99 100 100 99 99 96 97 97 97 97 96 96 98 92 98 7 99 98 99 99 99 99 98 98 98 98 99 96 97 97 97 97 96 96 98 92 97 8 97 96 97 97 97 99 98 99 99 99 99 96 98 98 98 98 97 97 99 93 98 9 98 97 98 98 98 100 99 99 100 99 99 96 98 98 98 98 97 97 99 93 98 10 98 97 98 98 98 100 99 99 100 99 99 96 98 98 98 98 97 97 99 93 98 11 98 97 98 98 98 100 99 99 100 100 99 97 98 98 98 98 97 97 99 93 98 12 98 97 98 98 98 100 99 99 100 100 100 97 98 98 98 98 97 97 99 93 98 13 94 93 94 94 94 95 95 94 95 95 95 95 97 97 97 97 97 97 97 94 97 14 96 95 95 95 96 97 96 96 97 97 97 97 97 98 98 99 98 98 98 94 99 15 97 96 96 96 97 98 97 97 98 98 98 98 96 97 99 99 98 98 99 93 98 16 96 96 96 96 96 98 97 97 98 98 98 98 95 97 98 98 98 98 99 93 98 17 96 95 96 96 96 97 96 96 97 97 97 97 97 98 98 97 99 99 99 94 99 18 95 94 94 94 95 96 95 95 96 96 96 96 97 97 96 96 98 100 98 94 98 19 95 94 94 94 95 96 95 95 96 96 96 96 97 97 96 96 98 100 98 94 98 20 97 96 97 97 97 99 98 98 99 99 99 99 96 98 99 99 98 96 96 93 98 21 91 90 91 91 91 92 92 92 92 92 92 92 93 93 92 92 93 92 92 93 94 22 96 95 95 95 96 96 96 96 96 96 96 96 97 98 97 96 98 98 98 97 93
Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-2011: 6. Eurasian-eagle-owl- KP-Q133: 7. A-Hubei-1-2010: 8. Ck-Jiangsu-k0402-2010: 9. Dk-Hokkaido-WZ83-2010: 10. Dk-Hokkaido-WZ101-2010: 11. Great-crested-grebe-Qinghai-2009:
Bảng 3.11. Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng về amino acid (dưới đường chéo) của gen NS2 giữa các
chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 100 100 100 99 98 99 98 98 98 98 98 97 97 98 97 98 96 96 98 93 98 2 100 100 100 99 98 99 98 98 98 98 98 97 97 98 97 98 96 96 98 93 98 3 100 100 100 99 98 99 98 98 98 98 98 97 97 98 97 98 96 96 98 93 98 4 100 100 100 99 98 99 98 98 98 98 98 97 97 98 97 98 96 96 98 93 98 5 99 99 99 99 98 99 97 98 98 98 98 96 96 97 96 98 96 96 98 92 97 6 98 98 98 98 97 99 99 100 100 99 100 98 98 99 98 99 97 97 99 94 99 7 99 99 99 99 98 99 98 99 99 98 99 97 97 98 97 98 96 96 98 93 98 8 98 98 98 98 97 100 99 99 99 99 99 97 98 98 98 99 97 97 99 93 98 9 98 98 98 98 97 100 99 100 100 99 100 98 98 99 98 99 97 97 99 94 99 10 98 98 98 98 97 100 99 100 100 99 100 98 98 99 98 99 97 97 99 94 99 11 97 97 97 97 96 99 98 99 99 99 99 98 98 99 98 99 97 97 99 94 98 12 98 98 98 98 97 100 99 100 100 100 99 98 98 99 98 99 97 97 99 94 99 13 95 95 95 95 94 96 95 96 96 96 95 96 98 98 98 98 98 98 98 94 99 14 96 96 96 96 95 98 97 98 98 98 97 98 98 98 97 98 97 97 98 94 98 15 97 97 97 97 96 99 98 99 99 99 98 99 97 99 99 99 98 98 99 95 99 16 96 96 96 96 95 98 97 98 98 98 97 98 96 98 99 98 98 98 98 94 98 17 97 97 97 97 96 99 98 99 99 99 98 99 97 99 100 99 98 98 99 94 99 18 95 95 95 95 94 96 95 96 96 96 95 96 95 97 97 98 97 100 97 94 98 19 95 95 95 95 94 96 95 96 96 96 95 96 95 97 97 98 97 100 97 94 99 20 98 98 98 98 97 100 99 100 100 100 99 100 96 98 99 98 99 96 96 94 98 21 89 89 89 89 88 90 90 90 90 90 90 90 90 91 90 90 90 90 90 90 95 22 96 96 96 96 95 98 97 98 98 98 97 98 98 100 99 98 99 97 97 98 91
Ghi chú : 1. Dk-VN-QT-801-2011; 2. Dk-VN-QT1603-2011: 3. Md-VN-LBM113-2012; 4. Md-VN-LBM132-2012; 5. EVM-Hunan-3-2011: 6. Eurasian-eagle-owl- KP-Q133: 7. A-Hubei-1-2010: 8. Ck-Jiangsu-k0402-2010: 9. Dk-Hokkaido-WZ83-2010: 10. Dk-Hokkaido-WZ101-2010: 11. Great-crested-grebe-Qinghai-2009:
NS1 Nucleotide Clade 2.3.2.1 Clade 2.3.2 Clade 2.3.4 Clade 2.3.2 DK-VN-QT800-2011 Dk-VN-QT1603-2011 Md-VN-LBM113-2012-AB742259 Md-VN-LBM132-2012-AB742267 A-Hubei-1-2010-CY098762 EVM-Hunan-3-2011-JX576790 Water-Hunan-7-2009-CY 098857 Dk-Hokkaido-WZ101-2010-AB612913 Dk-Hokkaido-WZ83-2010-AB612905 Eurasian-eagle-owl-KP-Q133-2011-JN808066 Ck-Jiangsu-k0402-2010-JQ638681 Great-crested-Qinghai-1-2009-CY063322) Black-crowned-heron-HK-659-2008-CY036233 Little-egret-HK-8863-2007-CY036209 Grey-heron-HK-10462008-CY 036249 Ck-Hunan-2008-GU182161 Water-Xinjiang-2009-CY098834 Dk-VN-208-2005-E U930944 Water-Hebei-2-2009-CY098778 A-VN-HN31388M1-2007-HM114589 A-VN-UT31239-2007-HM114557