Các thiết bị đƣơ ̣c sử dụng trong nghiên cƣ́u

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Máy PCR (GeneAmp PCR system 9700) Applied BioSciences (Mỹ)

2 Nguồn điện di PowerPac™ HC Bio–rad (Mỹ)

3 Bể điện di Mini–Sub Cell GT, MiniProtean 3 cell Bio–rad (Mỹ)

3 Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf (Đức)

4 Tủ lạnh – 20C và – 80C Nuaire (Mỹ)

5 Bể ổn nhiệt ED5 Julabo (Đức)

6 Tủ an toàn sinh học Nuaire (Mỹ)

Ngồi ra, cịn các thiết bị khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu nhƣ cân phân tích, cân kỹ thuật, máy vortex, máy minispin, lị vi sóng…

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để tiến hành phân tích đột biến A3243G và A10398G, chúng tơi thực hiện phƣơng pháp PCR-RFLP. Trƣớc hết ADN tổng số đƣợc tách chiết từ mô u và mô lân cận u. Tiếp đó, đoạn ADN chứa đột biến đƣợc nhân lên bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sự có mặt của đoạn gen chứa đột biến này đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di. Bƣớc tiếp theo chúng tôi thực hiện cắt đoạn gen này bằng enzym giới hạn thích hợp để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di. Để khẳng định kết quả, đoạn gen chứa đột biến đƣợc tinh sạch và đƣợc gửi đi giải trình tự.

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số từ mô

Mẫu mô đại trực tràng bao gồm mẫu mô u và mẫu mô lân cận khối u của cùng một bệnh nhân đƣợc lấy ra từ tủ 80C, rã đông và rửa bằng đệm Kali

phosphate 100mM, pH 8,0. Sau khi rửa, hai mẫu mô đƣợc cân với lƣợng tƣơng đƣơng 0,03–0,05g/mẫu và cho vào hai ống eppendorf riêng biệt.

Tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô- QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

 Bổ sung vào mỗi ống epp: 180 µl buffer ATL và 20 µl proteinase K, vortex và ủ ở 56ºC trong khoảng 3h để mô đƣợc thủy phân hoàn toàn.

 Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch cịn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl buffer AL vào mẫu, vortex trong 15s, và ủ ở 70ºC trong 10 phút. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch cịn dính trên nắp.

 Thêm 200 µl ethanol (96–100%) vào mẫu, vortex trong 15s. Ly tâm trong thời gian ngắn để loại dịch cịn dính trên nắp.

 Cho tồn bộ hỗn hợp vào cột QIAamp Spin Column. Đóng nắp, ly tâm 8000 rpm trong 1 phút. Đặt cột vào ống epp sạch và loại bỏ ống có chứa dịch.

 Bổ sung lên cột 500 µl buffer AW2. Đóng nắp, ly tâm ở tốc độ tối đa 14.000 rpm trong 3 phút. Có thể lặp lại bƣớc này thêm 1 phút nếu chƣa hết dịch trên cột.

 Thu mẫu trên cột: Đặt cột vào ống 1.5 ml sạch và loại bỏ ống có chứa dịch. Thêm 200 µl buffer AE hoặc nƣớc sạch. Đặt ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8000 rpm) trong 1 phút. Lặp lại bƣớc trên 2 lần.

 Làm khô dịch thu đƣợc bằng máy Speed vac trong 2h.

 Hịa tan ADN trong 50µl buffer AE , bảo quản ở –20ºC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

 Kiểm tra quá trình tách chiết ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8–1%.

2.2.2. Khuếch đại đoa ̣n gen 10398 và đoạn gen 3243 ADN ty thể bằng PCR

Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp là kỹ thuật cho phép nhân bản invitro các đoạn ADN (gen) lên hàng triệu lần so với ban đầu (1012–1013

bản sao). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng tổng hợp ADN invitro của ADN polymerase. Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại của 3 bƣớc cơ bản: biến tính (Denaturing), gắn mồi (Annealing) và tổng hợp (Extending).

Các cặp mồi đƣợc chúng tơi thiết kế bằng chƣơng trình Primer premier 5. Trình tự các cặp mồi đƣợc trình bày ở bảng 6.