Các cặp mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR

Tên mồi Trình tự mồi Kích thƣớc sản

phẩm (bp) 10398 f 5’-CCTGCCACTAATAGTTATGTC-3’ 246 r 5’-GATATGAGGTGTGAGCGATA-3’ 3243 f 5’-CTGTACGAAAGGACAAGAGA-3’ 218 r 5’-ACAATGAGGAGTAGGAGGTT-3’

PCR đƣơ ̣c thƣ̣c hiê ̣n với các thành phần của phản ứng nhƣ trong bảng 7. Bảng 7. Thành phần phản ứng PCR với thể tích phản ứng 12,5 l Thành phần Thể tích (l) Nồng độ cuối cùng Master Mix 2x 6,25 1X Primer F 10µM 0,25 0,2 M Primer R 10µM 0,25 0,2 M ADN khuôn 2 Nƣớc 3,75

Chu trình nhiệt đối với cặp mồi 10398 nhƣ sau:

2.2.3. Phân tích RFLP

Phƣơng pháp RFLP sử dụng các enzyme giới hạn thích hợp phân cắt sản phẩm PCR để nhận biết đột biến qua phổ băng điện di.

+ Vớ i đoa ̣n gen 10398 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzyme FastDigest® DdeI. Enzyme

này có vị trí nhận biết trên ADN nhƣ sau: 5’…C/TNAG…3’ 3’…GANT/C…5’

Phân tích vi ̣ trí nhâ ̣n biết các enzyme giới ha ̣n trên đoa ̣n gen 246 bp và nhâ ̣n thấy trong trƣờng hợp 10398A thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở một vị trí và tạo thành các đoa ̣n oligonucleotide có kích thƣớc 50 bp và 196 bp.

Trong trƣờng hợp 10398 G thì enzyme DdeI sẽ cắt đoa ̣n gen ở 2 vị trí và kết quả cắt enzyme thu đƣợc các đoạn oligonucleotide có kích thƣớc 38 bp, 50 bp và 158 bp.

+ Vớ i đoa ̣n gen 3243 ADN ty thể: sƣ̉ du ̣ng enzym e cắt FastDigest® HaeIII nhận biết vi ̣ trí cắt trên ADN ta ̣i trình tƣ̣:

5’…GG/CC…3’ 3’…CC/GG…5’

Đoa ̣n gen 3243 đƣơ ̣c nhân lên có kích thƣớc 218 bp. Trong trƣờng hợp khơng đột biến (3243A) thì HaeIII cắt đoa ̣n gen này ta ̣i hai vi ̣ trí , dẫn tới sản phẩm thu đƣơ ̣c là các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp và 169 bp.

Trong trƣờng hợp có đột biến 3243G thì vi ̣ trí này sẽ trở thành vi ̣ trí cắt của

HaeIII. Kết quả là sau khi cắt bằng enzyme HaeIII sẽ xuất hiê ̣n các đoa ̣n có kích thƣớc 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp.

Sản phẩm PCR đƣợc tiến hành phản ứng cắt với enzyme thích hợp theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất . Thành phần phản ứng cắt sử dụng HaeIII và DdeI

đƣơ ̣c mô tả trong bảng 8.

Bảng 8. Thành phần phản ứng cắt sử dụng enzyme cắt giới hạn HaeIII và DdeI

Thành phần Thể tích

10X FastDigestđ buffer 2àl Sản phẩm PCR (~0.2 µg) 10µl

FastDigestđ enzyme 1àl

Nƣớc Bổ sung đến đủ 30 µl

Thành phần phản ứng s au khi đƣơ ̣c trơ ̣n đều thì tiến hành ủ ở 37 0

C theo đúng khuyến cáo của nhà sản xuất. Hỗn hợp đƣợc trộn đều, ly tâm nhẹ, ủ 7–10 phút

trong bể ổn nhiệt ở 370C. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzyme trên gel polyacrylamide 8% và nhuộm bạc để quan sát kết quả.

2.2.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR và sản phẩm cắt bằng enzym giới hạn

Điện di là kỹ thuật đƣợc dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt nhƣ protein và các nucleic acid trên cơ sở kích thƣớc/khối lƣợng, điện tích và cấu hình của chúng. Khi các phân tử tích điện đƣợc đặt trong một điện trƣờng, chúng sẽ dịch chuyển hƣớng đến cực dƣơng (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Các nucleic acid có một điện tích âm khơng đổi nhờ khung phosphate của chúng và vì thế chỉ dịch chuyển hƣớng tới cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích thƣớc phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào

kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.

2.2.4.1. Điện di gel agarose

Điện di gel agarose đƣợc thực hiện với chất nền là agarose. Nồng độ agarose dùng trong điện di nằm trong khoảng 0,5 – 2,5%. Giới hạn phân tách của gel đƣợc trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Dải nồng độ gel agarose dùng trong phân tách acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Dãy kích thƣớc tách hiệu quả (kb)

0,5 2–25 0,7 0,8–10 1,2 0,4–5 1,5 0,2–3 2,0 0,1–2 2,5 0,05–1,5

Việc hiển thị các băng ADN trong gel agarose sau quá trình chạy điện di đƣợc thực hiện bằng cách nhuộm gel ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) (ủ gel trong dung dịch nhuộm chứa 200–300 ng EtBr/ml khoảng 30 phút) và có thể phát hiện dƣới ánh sáng tử ngoại (UV).

Chuẩn bị gel agarose 1,3% để kiểm tra sản phẩm PCR

 Cân 1,3 gam agarose dạng bột (Invitrogen), bổ sung 100ml đệm chạy TBE 1X pH 8,3 (Tris–base 0,09M; acid boric 0,09M; EDTA 4mM)

 Làm nóng chảy gel bằng cách đun trong lị vi sóng cho đến khi agarose tan hết (khoảng vài phút).

 Làm nguội gel đến khoảng 50–55C, đổ agarose vào khuôn điện di đã cài lƣợc để tạo giếng.

 Để gel đơng ở nhiệt độ phịng (20–30 phút).

 Sản phẩm PCR đƣợc trộn với loading dye (glycerol 30% v/v, bromphenol blue dạng vết) và nạp lên giếng điện di. Điện di với dòng điện 110 V trong khoảng 30 phút.

 Bản gel sau điện di đƣợc nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia tử ngoại (UV).

2.2.4.2. Điện di gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide. Gel polyacrylamide đƣợc tổng hợp ngay trƣớc khi dùng ở nhiệt độ phòng gồm 2 thành phần chính là acrylamide và bis– acrylamide. Quá trình tổng hợp nhờ xúc tác của Ammonim persulfate (APS) và TEMED. Khi trùng hợp từ hai thành phần chính trên sẽ hình thành một polymer dạng mạng lƣới. Tùy theo nồng độ của các chất thành phần mà gel tạo thành sẽ có hệ thống lỗ nhỏ, vừa hay lớn. Tƣơng tự, tùy hàm lƣợng của bis–acrylamide mà gel có mức độ liên kết chéo cao hay thấp. Hiệu quả của sự phân tách ADN trong gel phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide (bảng 10), kích thƣớc và điện tích của ADN.

Bảng 10. Khả năng phân tách của gel polyacrylamide đối với acid nucleic [6] Nồng độ gel (%w/v) Giới hạn phân tách với ADN (bp)

5 80500

8 60400

12 50300

15 40200

Chuẩn bị bản gel polyacylamide 8% dùng để đi ện di kiểm tra sản phẩm PCR đƣợc cắt bằng enzyme HaeIII và DdeI (bảng 11).

Bảng 11.Các thành phần cần sử dụng cho 1 bản gel dày 0,75 mm, kích thƣớc 7cm

Thành phần Thể tích

Monoacrylamide 30% 1,33 ml

TBE 1X 3,67 ml

APS 10% 37,5 l

TEMED 3 l

Kỹ thuật nhuộm bạc: Bản gel polyacrylamide sau khi điện di đƣợc nhuộm bạc

theo phƣơng pháp của Bassam (1991) [13], bao gồm các bƣớc sau:

 Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 30 phút.

 Rửa bằng nƣớc cất ba lần, mỗi lần cách nhau 5 phút.

 Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat (1,5g/l AgNO3; 0,056% formaldehyde) trong 30 – 40 phút, tránh ánh sáng.

 Rửa nƣớc khoảng 30 giây–1 phút.

 Hiện băng bằng dung dịch developer (30g/l Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/l natri thiosulfate Na2S2O3) trong 3–5 phút.

 Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic lạnh 7,5% trong 1–3 phút.

 Bảo quản gel bằng nƣớc cất.

 Quan sát kết quả dƣới ánh sáng trắng.

2.2.5. Tinh sạch ADN

Đoạn gen chứa đột biến A10398G đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR và đƣợc tinh sạch bằng kit QIAquick Gel Extraction Kit của hãng QIAGEN (Đức). Quy trình tinh sạch đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất nhƣ sau:

- Đoạn gen chứa đột biến A10398G sau khi đƣợc khuếch đại bằng PCR, đƣợc điện di trên gel agarose 1%.

- Cắt các mảnh gel agarose chứa ADN, cho các mảnh này vào ống sạch - Bổ sung 3 thể tích đệm QG cho một thể tích gel (100mg ≈ 100µl). - Ủ ở 50o

C trong 10 phút (hoặc cho đến khi miếng gel đã hịa tan hoàn tồn). Trong thời gian ủ, cứ 3 phút lại vortex ống.

- Sau khi gel đã hòa tan hoàn toàn, kiểm tra nếu màu sắc của hỗn hợp có màu vàng là đƣợc. Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc tím thì thêm 10 µl Natri acetat 3M, pH 5,0 vào hỗn hợp và mix.

- Thêm một thể tích isopropanol vào mẫu và mix

- Đƣa mẫu lên cột, ly tâm 1 phút, tốc độ 13000 rpm, nhiệt độ phòng.

- Đổ bỏ phần dịch qua cột, thêm 0,5 ml đệm QG lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút

- Để rửa, bổ sung 0,75 ml đệm PE lên cột, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút

- Đổ bỏ phần dịch qua cột, ly tâm cột thêm một phút ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm.

- Để thơi ADN: thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.

- Tiếp tục thêm 50 µl đêm EB lên màng, ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13000 rpm trong 1 phút.

- Speed vac ống đến thể tích 20 µl, điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 8%.

ADN sau khi tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự. 2.2.6. Tính tốn thống kê

Xƣ̉ lý các sớ liê ̣u phân tích theo các phƣơng pháp thố ng kê thƣờng dùng . So sánh các đặc trƣng thống kê mẫu bằng phép ki ểm định 2 với mức ý nghĩa α = 0,05.

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN ĐIỂM A3243G CỦA GEN tARN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

3.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô ung thƣ đại trực tràng

Sử dụng kit tách chiết ADN QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN (Đức), chúng tôi đã tách chiết đƣợc ADN từ 61 cặp mẫu mô (mẫu u và mẫu lân cận u) của 61 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng. Kết quả tách chiết ADN tổ ng số tƣ̀ các mẫu mơ đƣợc minh họa trong hình 7.

Hình 7. Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ mô

(điện di trên gel agarose 1%, nhuộm ethidium bromide). Giếng 1, 3, 5: ADN tổng số mẫu mô lân cận u

Giếng 2, 4, 6: ADN tổng số mẫu mô u

Qua hình ảnh điện di trên ta thấy các băng ADN tổng số tƣơng đối sáng, gọn chứng tỏ hàm lƣợng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen 3243 của ADN ty thể

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 3243 với khuôn là ADN tổng số từ mô, đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể đã đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan sát dƣới tia cực tím. Kết quả điện di đƣợc thể hiện nhƣ trong hình 8.

Hình 8. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 3243

(điê ̣n di trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide).

Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp Giếng (-): Đối chứng âm Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân

cận u

Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u

Kết quả điện di cho thấy đã thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc 218bp, các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng tỏ khơng có hiện tƣợng bắt cặp khơng đặc hiệu. Sản phẩm PCR này đƣợc tiếp tục phân tích bằng kỹ thuật RFLP để xác định đột biến.

3.1.3. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen chứa vị trí 3243 ADN ty thể

Để xác định đột biến điểm A3243G, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp RFLP. Chúng tôi đã tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 3243 với enzyme giới hạn

Trong trƣờng hợp không có đô ̣t biến thì đoa ̣n gen 218 bp có chứa hai vị trí nhận biết của enzyme, và sẽ bi ̣ cắt thành ba đoa ̣n nhỏ hơn có kích thƣớc 22 bp, 27 bp và 169 bp. Trong trƣờng hợp đô ̣t biến A  G xảy ra thì đoa ̣n gen 218 bp sẽ có thêm một vị trí nhận biết nữa của enzyme giới hạn, kết quả là đoạn gen sẽ bị cắt thành các đoạn nhỏ có kích thƣớc là 22 bp, 27 bp, 72 bp và 97 bp. Sản phẩm của quá trình xử lý với enzyme cắt đƣợc điện di kiểm tra cùng với sản phẩm PCR trên polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV bƣớc sóng 245 nm (hình 9).

Hình 9. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 3243 vớ i enzyme HaeIII.

(điện di trên gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide). Giếng 1: Thang chuẩn ADN 100bp

Giếng 3, 5: sản phẩm PCR từ mô u Giếng 7: sản phẩm PCR từ mô lân cận u

Giếng 2, 4: sản phẩm sau cắt bằng HaeIII từ mẫu mô u

Giếng 6: sản phẩm sau cắt bằng HaeIII từ mẫu mô lân cận u

thƣớc 22 bp, 27 bp không quan sát đƣợc do gel không phân tách đƣợc. Nhƣ vậy ở các giếng này không xuất hiện đột biến. Chúng tôi đã tiến hành cắt enzym với 61 cặp mẫu, kết quả thu đƣợc khơng có đột biến.

Đột biến A3243G trên gen MT -TL1 mã hóa cho tRNALeu (UUR)

đã đƣơ ̣c phát hiện ra đầu tiên nhƣ là mô ̣t nguyên nhân di truyề n của bệnh MELAS [31]. Cho đến nay các nghiên cứu về đột biến A3243G chỉ tập trung vào một số bệnh cơ thần kinh, tiểu đƣờng. Chỉ có một nghiên cứu duy nhất phát hiện đột biến A3243G trên bệnh nhân ung thƣ trực tràng. Lorenc và cs (năm 2003) khi nghiên cứu các đột biến ADN ty thể gồm đột biến tRNA, rRNA và một số gen ty thể trên một số mẫu ung thƣ, đã phát hiện một mẫu ung thƣ trực tràng có đột biến A3243G dạng đồng nhất (homoplasmic) [46]. Nhƣ vậy có thể thấy rằng đột biến A3243G là khá hiếm gặp ở bệnh ung thƣ.

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA HÌNH A10398G CỦA GEN ND3 ADN TY THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP THỂ BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP

3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen 10398 của ADN ty thể

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu 10398 với khuôn là ADN tổng số từ mơ, đoạn gen mang đa hình A10398G đã đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide, quan sát dƣới tia cực tím. Kết quả điện di đƣợc thể hiện nhƣ trong hình 10.

Hình 10. Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 10398

(điện di trên gel agarose 1,7%, nhuộm ethidium bromide). Giếng M100: thang chuẩn ADN 100bp Giếng (-): Đối chứng âm Giếng 1, 3, 5: Sản phẩm PCR mẫu mô lân

cận u

Giếng 2, 4, 6: Sản phẩm PCR mẫu mô u

Kết quả điện di cho thấy đã thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc 246bp, các băng sáng, rõ nét và không xuất hiện băng phụ chứng tỏ khơng có hiện tƣợng bắt cặp khơng đặc hiệu. Sản phẩm PCR này đƣợc tiếp tục phân tích RFLP để xác định đột biến.

3.2.2. Kết quả phân tích RFLP đoạn gen mang đa hình A10398G

Chúng tơi đã tiến hành xử lý sản phẩm PCR đoạn gen 10398 với enzyme giới hạn DdeI. DdeI là enzyme endonuclease nhận biết ADN tại trình tự:

5’…C/TNAG…3’ 3’…GANT/C…5’

Trong trƣờng hợp alen A xuất hiện ở vị trí 10398, enzyme DdeI có một vị trí nhận

biết trên đoạn gen đƣợc khuếch đại, kết quả sẽ cắt đƣợc hai băng kích thƣớc 50 bp và 196 bp. Trƣờng hợp alen G xuất hiện, sẽ có thêm một vị trí nhận biết của DdeI, kết quả sẽ thu đƣợc ba băng có kích thƣớc lần lƣợt là 38 bp, 50 bp và 158 bp. Các

sản phẩm sau cắt đƣợc điện di cùng với sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6%, nhuộm Ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV bƣớc sóng 245 nm (hình 11).

Hình 11. Ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn 10398 vớ i enzyme DdeI

(điện di trên gel polyacrylamide 6%, nhuộm ethidium bromide).

Từ kết quả thu đƣợc trong hình chúng tơi nhận thấy sản phẩm PCR sau khi cắt bằng DdeI trên bản điện di ở giếng số 6 xuất hiện băng kích thƣớc 196 bp. Nhƣ vậy ở giếng này là 10398A. Mặt khác ở các giếng số 2, 4 sản phẩm PCR sau khi cắt xuất hiện các băng 158bp, 50bp, 38bp. Đây là những mẫu mang alen G ở vị trí 10398. Chúng tơi đã tiến hành cắt enzym với 61 cặp mẫu và đã thu đƣợc kết quả trong đó có 28 cặp mẫu mang alen A ở vị trí 10398 và 33 cặp mẫu mang alen G ở vị trí này.

3.2.3. Kết quả giải trình tự đoạn gen mang đột biến A10398G

Sử dụng kỹ thuật RFLP, chúng tôi đã xác định đƣợc đột biến A10398G ở một số cặp mẫu. Để khẳng định kết quả, chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau tinh sạch đƣợc lấy ra kiểm tra sự hiện diện của băng