Hình 3.3.1.5 (a) Mạch xoắn; (b) Mạch vạch a b a b
38
Hình 3.3.1.6 Tinh thể calci oxalat hình khối
3.3.2Soi bột thân Cát Lồi
Bột thân Cát Lồi màu nâu đen, không mùi, vị ngọt dịu. Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh mơ mềm chứa tinh thể hình khối; Mảnh biểu bì; Mạch vạch, mạch xoắn, mạch điểm; Lơng che chở đơn bào đầu nhọn, lông che chở đa bào; Tế bào sợi.
Hình 3.3.2.1 Bột thân Cát Lồi
39
Hình 3.3.2.3 Mảnh mơ mềm chứa tinh thể calci oxalat hình khối
Hình 3.3.2.4 (a) Mạch vạch; (b) Mạch xoắn; (c) Mạch điểm
Hình 3.3.2.5 (a) Lơng che chở đa bào; (b) Lông che chở đơn bào; (c) Sợi
a b c
c b
40
3.3.3Soi bột rễ Cát Lồi
Bột rễ Cát Lồi màu nâu đen, vị ngọt. Soi kính hiển vi thấy: Trên quan trường có nhiều hạt tinh bột bao phủ; Tinh bột hình trứng; Mạch điểm; Mạch xoắn.
Hình 3.3.3.1 Bột rễ Cát Lồi
Hình 3.3.3.2 Bột rễ Cát Lồi (10x)
41
Hình 3.3.3.4 (a) Mạch điểm; (b) Mạch xoắn
3.4 Kết quả định tính
3.4.1Định tính bằng phản ứng hóa học
Dịch chiết Ether:
- Định tính tinh dầu: Lấy khoảng 5ml ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cạn. Nếu cắn
có mùi thơm nhẹ, thêm vào cắn một ít cồn cao độ (TT) rồi lại bốc hơi cho đến cắn. Cắn có mùi thơm nhẹ đặc trưng. Có tinh dầu.
Hình 3.4.1.1 Kết quả định tính tinh dầu
Kết luận: Khơng có tinh dầu (-)
- Định tính chất béo: Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên cùng một chỗ trên một miếng
giấy mỏng, hơ hoặc sấy nhẹ cho bay hết dung mơi (và hết mùi thơm nếu dịch chiết có tinh chiết có tinh dầu). Nếu tại nơi nhỏ dịch chiết có vết trong mờ: có chất béo.
Hình 3.4.1.2 Kết quả định tính chất béo (-)
42
- Định tính carotenoid: Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi nhẹ tới
cắn. Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu xanh lục ngả sang màu xanh dương.
Hình 3.4.1.3 Kết quả định tính Carotenoid
Kết luận: Khơng có Carotenoid (-)
- Định tính triterpenoid: Lấy khoảng 5 ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn.
Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipet Pasteur thêm cẩn thận 1-2 ml H2SO4 đđ lên thành ống nghiệm để nghiêng cho acid chảy xuống đấy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím : Có triterpenoid.
Hình 3.4.1.4 Kết quả định tính triterpenoid
Kết luận: Có triterpenoid (+)
- Định tính alkaloid: Lấy khoảng 10ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2-4ml dung dịch acid hydrocloric 1%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng thuốc thử Bouchardat, Mayer và Dragendorff.
So sánh kết quả với ống chứng khơng có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hơn so với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid.
Màu xanh lục Màu nâu đỏ
43
Hình 3.4.1.5 Kết quả định tính alkaloid (-)
(1) Bouchardat; (2) Mayer; (3) Dragendorff; (4) Ống chứng Kết luận: Khơng có alkaloid (-)
- Định tính coumarin: Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn.
Hòa cắn trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0.5ml KOH 10%, và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Dung dịch trong ống 1 có huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2: có Coumarin
Hình 3.4.1.6 Kết quả định tính coumarin (-)
Kết luận: Khơng có coumarin (-)
- Định tính anthraquinon: Các hợp chất anthraquinon (dạng tự do, oxy hóa) có trong
dịch chiết ether được định tính bằng phản ứng Borntrager
Lấy khoảng 5ml dịch ether cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu hồng tới đỏ: Có anthraquinon dạng tự do.
(1) (2) (3) (4)
(1) (2)
44
Hình 3.4.1.7 Kết quả định tính Anthraquinon (-)
Kết luận: Khơng có Anthraquinon (-)
Dịch chiết cồn
- Định tính alkaloid: Lấy khoảng 5ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa
cắn trong 2-4ml dung dịch acid hydrocloric 5%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng thuốc thử Bouchardat, Mayer và Dragendorff. So sánh kết quả với ống chứng khơng có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hơn so với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid.
Hình 3.4.1.8 Kết quả định tính Anthraquinon (-)
(1) Bouchardat; (2) Mayer; (3) Dragendorff; (4) Ống chứng Kết luận: Khơng có Ankaloid (-)
- Định tính coumarin Lấy khoảng 5ml dịch cổn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa
cắn trong 2ml cồn 70%. Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào ống thứ nhất 0.5ml KOH 10%, và ống thứ 2 một lượng nước cất tương đương. Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Sự xuất hiện của ống thứ nhất chứng tỏ có sự có mặt của coumarin. Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2.5ml nước cất. Nếu dung dịch trong ống 1 trong hơn dung dịch trong ống 2: Có coumarin
45
Hình 3.4.1.9 Kết quả định tính Coumarin (-)
Kết luận: Khơng có Coumarin (-)
- Định tính glycosid tim:
a. Định tính vịng lacton 5 cạnh:
Lấy 5ml dịch cổn cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa lại cắn với 2ml cồn, gạn dịch cổn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Cho 2-3 giọt dung dịch m-dinitrobenzen 1% trong cồn 96 (rồi thêm vào 3 giọt KOH 5%) (Phản ứng Raymond-Marthoud). Nếu xuất hiện màu tím: Có các cardenolid.
Hình 3.4.1.10 Kết quả định tính vịng lacton 5 cạnh (-)
b. Định tính đường 2-desoxy:
Lấy 5ml dịch cồn cho vào chén sứ bốc hơi cho tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bơng gịn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: Có đường 2-desoxy.
Hình 3.4.1.11 Kết quả định tính đường 2-desoxy (-)
Kết luận: Khơng có Glycosid (-)
(1) (2)
46 - Định tính flavonoid:
a. Định tính các dẫn chất có cấu trúc -pyron và -dihydropyron
Lấy khoảng 5 ml dịch cồn cho vào chén sứ, bốc hơi còn khoảng 2 ml và gạn dịch cồn vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột magiesi kim loại và 0,5 ml HCl đđ. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đó : Có flavonoid
Hình 3.4.1.12 Kết quả định tính -pyron và -dihydropyron
b. Định tính anthrocyanid
Lấy 1ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2 – 3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%. Có anthocyanosid.
Hình 3.4.1.13 Kết quả định tính anthrocyanid
c. Định tính proanthocyanidin
Lấy 5ml dịch chiết cho vào 1 ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ. Có proanthocyanidin.
47
Hình 3.4.1.14 Kết quả định tính proanthocyanidin
Kết luận: Khơng có Flavonoid (-)
- Định tính tanin:
Lấy 2ml dịch chiết cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn với 4ml nước trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào 2 ống nghiệm
(1) Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0.5ml dịch chiết với 1ml nước cất. thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu. Có polyphenol
(2) Ống nghiệm thứ hai: Thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với ống chứng chứa dịch chiết ban đầu. Nếu có tủa bơng trắng. Có tannin
Hình 3.4.1.15 Kết quả định tính tanin
Kết luận: Khơng có Tanin (-)
- Định tính saponin: Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cơ trên bếp cách thủy tới
cắn. Hịa cắn trong 5ml cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền trong 15 phút: Có saponin
(1) (2)
48
Hình 3.4.1.16 Kết quả định tính saponin
Kết luận: Có Saponin (+)
- Định tính các chất khử: Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, bốc hơi dịch cồn
đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0.5ml dung dịch Fehling A và 0.5 ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: Có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử)
Hình 3.4.1.17 Kết quả định tính chất khử
Kết luận: Có chất khử (++)
- Định tính các acid hữu cơ: Lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Pha loãng
với 1ml nước và thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2SO4: Có acid hữu cơ
Hình 3.4.1.18 Kết quả định tính acid hữu cơ
Kết luận: Khơng có acid hữu cơ (-)
Dịch chiết nước
Tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm
49 - Định tính alkaloid
Lấy khoảng 10ml dịch nước cho vào một bình lắng ngạn 50ml, kiềm hóa bằng NH4OH 10% đến pH 10 và chiết bằng chloroform ( 10x3 lần). Gộp chung và rửa lớp dung môi với 10ml bằng nước cất. Lắc lớp ether với dung dịch HCl 5% ( 2ml x 3 lầm). Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử: Mayer, Bertrand và Bouchardat.
TT Bouchardat : tủa đỏ cam
TT Dragendorff : tủa đỏ cam
TT Valse - Mayer : tủa trắng - vàng nhạt
So sánh với ống chứng. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: Có alkaloid
(1) Bouchardat; (2) Dragendorff; (3) Valse-Mayer; (4) Ống chứng
Hình 3.4.1.19 Kết quả định tính alkaloid
Kết luận: Khơng có ankaloid (-)
- Định tính Glycosid tim
a. Định tính vịng lacton 5 cạnh: Lấy 5ml dịch chiết nước cho vào chén sứ bốc hơi đến cắn. Hòa tan cắn với 2ml cồn 25%, gạn dịch cồn vào ống nghiệm nhỏ. Cho 2-3 giọt dd 1% m-dinitrobenzen/ cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5%. Xuất hiện màu tím: có các cardenolid
Hình 3.4.1.20 Kết quả định tính vịng lacton 5 cạnh
50
b. Định tính đường 2 -desoxy: Lấy 5ml dịch chiết nước bốc hơi đến cắn. Hòa tan cắn với 5ml xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bơng gịn, cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: có đường 2-desoxy
Hình 3.4.1.21 Kết quả định tính đường 2-desoxy
Kết luận: Khơng có Glycosid tim (-)
- Định tính flavonoid
a. Định tính các dẫn chất có nhân - pyron và - dihydropyron
Lấy khoảng 5ml dịch nước cho vào chén sứ bốc hơi đến cắn. Hòa tan cắn trong 2ml cồn 25% , lọc vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột Mg và 0,5ml HCL đđ ( phản ứng cyanidin). Nếu dd có màu hồng tới đỏ: có flavonoid
Hình 3.4.1.22 Kết quả định tính nhân - pyron và - dihydropyron
b. Định tính anthocyanosid
Lấy 1 ml dịch chiết nước cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. THêm 2-3 giọt dung dịch acid HCL 10%. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hóa bằng dung dịch NaOH 10%: có anthocyanosid
51
Hình 3.4.1.23 Kết quả định tính anthocyanid
c. Định tính Proanthocyanidin
Lấy 5ml dịch chiết cho vào ống nghiệm. Thêm 2ml dung dịch HCL 10% và dung trong bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng tới đỏ. Có proanthocyanidin.
Hình 3.4.1.24 Kết quả định tính Proanthocyanidin
Kết luận: Khơng có Flavonoid (-)
- Định tính tanin
(1) Lấy 0,5ml dich chiết cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. THêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: Có polyphenol.
(2) Lấy 2ml dịch chiết, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin- muối lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu có tủa bơng trắng: Có tanin.
Hình 3.4.1.25 Kết quả định tính tanin
Kết luận: Khơng có Tanin (-)
52 - Định tính saponin
Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn. Hòa cắn trong 5ml cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 5ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền trong 15 phút: Có saponin
Hình 3.4.1.26 Kết quả định tính saponin
Kết luận: Có Saponin (+++)
- Định tính hợp chất khử
Lấy 5ml dịch chiết cơ cạn, hịa tan cắn trong cồn 25%, lọc. Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 dd Fehling A , 0,5 ml Fehling B. đun cách thủy 5phút. nếu có kết tủa đỏ ghạch lắng dưới đáy ống: có hợp chất khử (chủ yếu là đường khử)
Hình 3.4.1.27 Kết quả định tính chất khử
Kết luận: Có chất khử (+)
- Định tính hợp chất Polyuronid
Nhỏ từng giọt 2ml dịch chiết nước vào một ống nghiệm có chứa 10ml cồn 95%. nếu có nhiều tủa bơng dược tạo thành: có các polyuronid
Hình 3.4.1.28 Kết quả định tính polyuronid Kết luận: Có hợp chất Polyuronid (+) Bọt bền >30 phút Tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm Tủa bông
53
BẢNG TĨM TẮT KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HĨA THỰC VẬT
(-) Khơng có (±) Nghi ngờ (+) có ít (++) có nhiều (+++) có rất nhiều
Ghi chú: Có thể phản ứng nhưng khơng thực hiện
Khơng có mặt nhóm hợp chất trong dịch chiết
Nhóm hợp chất Thuốc thử Cách thực hiện Phản ứng dương tính Kết quả định tính trên các dịch chiết Kết quả định tính chung Dịch chiết ether Dịch chiết cồn Dịch chiết nước
Chất béo Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ - - - Khơng có Carotenoid Carr-Price Xanh→ đỏ
H2SO4 Xanh dương hay lục→ xanh dương
-
Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Có mùi thơm - Khơng có Triterpenoid tự
do Liebermann-Burchard
Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục
+ Khơng có
Alkaloid T/thử chung alkaloid Kết tủa - - - Khơng có Coumarin Phát quang trong
kiềm Phát quang mạnh hơn
- - Khơng có Anthraglycosid KOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ - Khơng có Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ - - - Khơng có Glycosid tim Thuốc thử vịng
lacton Tím
- Khơng có T/thử đường 2-desoxy Đỏ mận - Khơng có
Anthocyanosid HCl Đỏ - - Khơng có
KOH Xanh - - Khơng có
Proanthocyanidin HCl/toĐỏ - - Khơng có Tannin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen
(Polyphenol)
- + Nghi ngờ Dd gelatin muối Tủa bông trắng (Tannin) - + Nghi ngờ Saponin Tt Liebermann Có vịng tím nâu
Lắc mạnh dd nước Bọt bền ++ +++ Có nhiều Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt - - Khơng có
Chất khử T/thử Fehling Tủa đỏ gạch + + Có Hợp chất
polyuronic
Pha lỗng với cồn
90% Tủa bơng trắng – vàng nâu
54
3.4.2Định tính Saponin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
Chuẩn bị mẫu: Lấy 3g bột thân, thêm 10 ml Methanol 70%, đun cách thủy 15 phút,
lọc. Dịch lọc được dùng chấm sắc ký. Lặp lại quá trình chiết 3 lần thu được 3 mẫu dung dịch thử. Khai triển 3 mẫu trên cùng một bản mỏng với điều kiện sắc ký như sau:
Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck), bản mỏng silical gel 60 RP – 18 F254S
(Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C trong 60 phút trước khi dùng.
Phát hiện vết: quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm, phun thuốc
thử vanilin sulfuric (VS) và sấy bản mỏng ở 105o C cho đến khi rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Tiến hành: chấm riêng biệt 10 µl mỗi mẫu thử lên bản mỏng đã hoạt hóa ở
105°C trong 1 giờ, tiến hành sắc ký theo DĐVN V, phụ lục 5.4. Sau khi triển khai hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, sấy bay hơi hết dung môi. Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm, UV 366nm. Phun thuốc thử. Sấy bản mỏng ở 105°C đến khi hiện vết. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường
o (1) Dung môi khai triển: cloroform – methanol – nước (6,5; 3,5: 1)
Soi đèn UV 254nm Soi đèn UV 365nm Sau khi nhúng TT VS
Hình 3.4.2.1 SLKM Saponin hệ cloroform – methanol – nước (6,5; 3,5: 1)
o (2) Dung môi khai triển: cloroform – methanol (8:2)
Rf = 0.13 Rf = 0.6 Rf = 0.73 Rf = 0.78 0 Rf = 0.46
55
Phát hiện vết: quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm, phun
thuốc thử vanilin sulfuric (VS) và sấy bản mỏng ở 105o C cho đến khi rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường.
Soi đèn UV 254nm Soi đèn UV 365nm Sau khi nhúng TT VS