Bảng 3.3 Kết quả bán định lượng hàm lượng H3BO3 trong mẫu
2.3. Phương pháp nghiên cứu (kỹ huật phân tích hàn the)
Hàn the được biết đến là tên dân gian và thường được gọi theo tên hóa học là natri borat hay axit boric, nên tiến hành thực nghiệm áp dụng tiêu
18
chuẩn TCVN 8895:2012 “ Thực phẩm- Xác định natri borat và axit boric- Phương pháp định tính và bán định lượng” [17].
2.3.1. Phương pháp định tính
Nguyên tắc
Mẫu thực phẩm được axit hóa bằng axit clohydric, sau đó đem đun nóng trên nồi cách thủy. Axit boric (H3BO3) hoặc natri borat (Na2B4O7) được phát hiện bằng giấy nghệ. Khi có mặt axit boric hoặc natri borat thì giấy nghệ chuyển từ màu vàng sang đỏ cam, giấy nghệ này sẽ chuyển màu xanh đậm trong môi trường kiềm và chuyển lại màu đỏ hồng trong môi trường axit.
Kỹ thuật pha hóa chất
+ Cồn 80 độ: đong 89 ml cồn 90 độ rồi cho nước cất vừa đủ 100 ml.
+ Chuẩn bị giấy nghệ: Cân từ 1,5 g đến 2 g bột nghệ, cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml cồn 80 độ. Lắc mạnh trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc vào đĩa thuỷ tinh đáy phẳng (ví dụ đĩa Petri). Nhúng giấy lọc vào dịch lọc cho thấm đều. Lấy giấy lọc ra, để khơ ở nhiệt độ phịng, sau khoảng 1 giờ cắt giấy lọc thành những dải giấy có kích thước 1 cm x 6 cm. Có thể
chuẩn bị giấy nghệ bằng nghệ tươi. Bảo quản giấy nghệ trong lọ kín, tránh ánh sáng, ẩm và CO2, SO2, NH3, NO,… Sử dụng giấy nghệ trong vòng 10 ngày sau khi chuẩn bị [17].
Cách tiến hành
+ Chuẩn bị mẫu thử:
Bước 1: Nghiền nhỏ 25 g mẫu thử trong cối sứ. Bước 2: Chuyển mẫu đã nghiền vào cốc có mỏ.
Bước 3: Đun nhẹ mẫu trên nồi cách thủy với lượng nước vừa đủ để mẫu chuyển sang dạng bán rắn hoặc lỏng.
Bước 4: Axit hóa mẫu thử bằng axit clohydric, dùng 7 ml dung dịch HCl 36% cho 100 ml mẫu thử.
Bước 5: Để lắng hoặc ly tâm để lấy phần dịch trong để phân tích.
Lưu ý: nếu mẫu chứa chất béo thì làm lạnh bằng nước đá hoặc để trong tủ lạnh rồi gạn bỏ lớp chất béo đã đơng lại. Nếu mẫu có màu dùng sợi len lông cừu vào dung dịch để khử màu.
+ Phép thử sơ bộ: Nhúng giấy nghệ vào mẫu thử đã axit hóa cho thấm đều. Lấy ra và để khơ tự nhiên.
Nếu màu của giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ cam thì tiếp tục hơ giấy nghệ trên miệng lọ dung dịch amoniac sau đó hơ trên miệng lọ dung dịch axit clohydric.
Tiến hành đồng thời một mẫu trắng thay 25 g mẫu thực phẩm bằng 25 ml nước và thực hiện như trên.
+ Phép thử khẳng định:
Bước 1: Cân 25 g mẫu thử đã nghiền nhỏ. Bước 2: Kiềm hóa bằng nước vơi trong.
Bước 3: Cho bay hơi đến khô trên nồi cách thủy.
Bước 4: Nung mẫu thử đã làm khơ trong lị nung ở nhiệt độ từ 500 đến 550 độ C cho đến khi các chất hữu cơ hóa tro.
Bước 5: Để nguội, thêm 15 ml nước, dùng đũa thủy tinh khuấy đều rồi thêm từng giọt axit clohydric đến khi hỗn hợp có tính axit rõ rệt (sử dụng giấy quỳ để kiểm tra).
Bước 6: Nhúng giấy nghệ vào hỗn hợp trên và hong khơ.
Đọc kết quả
Mẫu thử có chứa axit boric hoặc natri borat nếu màu của giấy nghệ chuyển từ vàng sang đỏ cam.
Khi tiếp tục hơ giấy nghệ trên hơi amoniac thì màu đỏ cam chuyển thành xanh đậm.
Và giấy chuyển lại màu hồng khi hơ giấy nghệ trên hơi axit clohydric. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,001%
20
2.3.2. Phương pháp bán định lượng
Nguyên tắc:
Dung dịch mẫu thử được axit hóa bằng axit clohydric. So sánh màu của giấy nghệ được nhúng vào dung dịch thử với giấy được nhúng vào dung dịch chuẩn để ước lượng khoảng giá trị hàm lượng axit boric (hoặc natri borat quy về axit boric) có trong mẫu thử.
Pha chuẩn gốc
Dung dịch axit boric chuẩn: cân 1 g axit boric chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc cho axit boric tan hết (có thể đun nóng nhẹ trên nồi cách thủy cho tan hoàn toàn).
Chuẩn bị mẫu thử và dãy dung dịch
chuẩn + Chuẩn bị mẫu thử:
Bước 1: Nghiền nhỏ mẫu thử trong cối sứ.
Bước 2: Cân chính xác 25 g mẫu đã nghiền, cho vào bình nón dung tích 125 ml chứa 50 ml nước.
Bước 3: Dùng đũa thủy tinh khuấy trộn mẫu.
Bước 4: Đậy bình nón bằng mặt kính đồng hồ đun mẫu thử sơi trên nồi cách thủy.
Bước 5: Làm nguội bằng cách cho mẫu vào cốc có mỏ dung tích thích hợp và bỏ vào tủ lạnh cho đến khi chất béo đông lại (khoảng 30 phút).
Bước 6: Loại bỏ chất béo đông đặc và lọc mẫu thử. + Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn:
Dùng pipet lấy lần lượt 0,00; 0,05; 0,10; 0,20; 0,50; 0,75; 1,00; 2,50; 5,00 ml dung dịch axit boric chuẩn, cho vào ống nghiệm dung tích 15 ml. Pha lỗng dung dịch bằng nước đến 10 ml và thêm 0,7 ml dung dịch axit clohydric. Đậy nút ống nghiệm để tránh bay hơi. Dung dịch màu chuẩn đã pha dùng trong 6 tháng khi bảo quản kín trong ống nghiệm.
+ Xác định:
21
Dùng pipet lấy 10 ml dịch lọc của mẫu thử đã chuẩn bị cho vào ống nghiệm 15 ml, thêm 0,7 ml dung dịch axit clohydric. Đậy nút ống nghiệm và trộn đều.
Dùng giấy nghệ đã đánh dấu kí hiệu một đầu là T (mẫu thử) nhúng đầu không đánh dấu vào dịch thử thu được ( khoảng 1/2 chiều dài mẫu giấy) dùng kẹp lấy ra để khơ trong khơng khí.
Tương tự dùng những tờ giấy nghệ được đánh số theo dãy dung dịch chuẩn (có số tương ứng) sau đó để khơ ngồi khơng khí.
Đọc kết quả sau 1 giờ nhưng không quá 2 giờ so màu của các dải giấy nghệ bằng cách đặt giấy nghệ được nhúng dung dịch thử vào giữa từng cặp giấy chuẩn trên nền trắng như là giấy trắng, dưới ánh sáng tự nhiên là tốt nhất để nhận biết.
Sử dụng các dải giấy chuẩn mới cho mỗi mẫu thử.
Nếu màu của giấy thử nằm ngoài dải màu của dãy chuẩn thì pha lỗng dịch lọc: ví dụ dùng 5 ml dịch lọc, 5 ml nước, 0,7 ml dung dịch axit clohydric và nhân kết quả cuối cùng với 2.
Biểu thị kết quả
Với thể tích dịch lọc 10 ml (ứng với 5 g mẫu thử) thì các dung dịch màu chuẩn đã pha ứng với hàm lượng axit boric trong mẫu thử lần lượt là 0,00; 0,01; 0,02; 0,04; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 1,00 % khối lượng.
Bảng 2.2. Pha dãy chuẩn và nồng độ axit boric trong dãy chuẩn
HóaỐng chất H3BO3 (1%) ml Nước cất ml Hàm lượng H3BO3 (mg/10)
Dựa vào nồng độ dung dịch xử lí giấy chuẩn đã biết để xác định được hàm lượng axit boric trong mẫu thử tương ứng bằng cách so màu giấy chuẩn và giấy thử.
Tính kết quả:
- Nếu màu của giấy mẫu thử tương đương màu của giấy chuẩn nào thì nồng độ H3BO3 trong dịch phân tích tương đương với nồng độ H3BO3 của ống chuẩn tương ứng với giấy chuẩn đó.
- Nếu mẫu nằm giữa 2 chuẩn thì giá trị được ước lượng giữa hai khoảng
đó.
- Nếu màu giấy mẫu thử vượt quá màu dãy giấy chuẩn thì phải làm lại thử nghiệm với sự pha loãng của dịch thử và đánh giá kết quả theo dãy chuẩn như trên: ví dụ dùng 5 ml dịch lọc, 5 ml nước, 0,7 ml dung dịch axit clohydric và nhân kết quả cuối cùng với 2 thì hệ số pha loãng ở đây là 1/2.
Nồng độ H3BO3 trong mẫu phân tích được tính theo cơng thức sau: C=A/5*100
Trong đó:
C: Số mg H3BO3 trong 100 g mẫu phân tích.
A: Số mg H3BO3 trong 10 ml dung dịch ống chuẩn có màu bằng ống thử.
5: Lượng mẫu thực phẩm tương ứng với 10ml dịch chiết dùng cho thử
nghiệm.
CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Định tính hàn the
Trong quá trình khảo sát quanh khu vực ĐHQGHN, các thực phẩm có khả năng được sử dụng hàn the làm phụ gia trong chế biến và được bán phổ biến nhất là bún, bánh giò, giò và chả. Mặc dù hàn the mang đến nhiều tác hại như gây kích ứng dạ dày, buồn nơn, nơn, ảnh hưởng đến thần kinh, gan, thận, ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của cả nam và nữ thậm chí có thể dẫn đến vơ sinh,… Trên thực tế khi lấy mẫu: 10 mẫu bún (kí hiệu từ b1-b10), 5 mẫu bánh giị (kí hiệu B1-B5), 5 mẫu giị (kí hiệu G1-G5) và 4 mẫu chả (kí hiệu C1-C4) tại khu vực này và làm kỹ thuật phân tích định tính theo mục 2.3.1. Một số hình ảnh kết quả của các mẫu phân tích:
Hình 2.1. Kết quả mẫu dương tính (C1,C3,C4), âm tính (C2) với hàn the và mẫu trắng
24
Hình 2.2. Mẫu dương tính với hàn the C4 khi hơ trên dung dịch NH3
Hình 2.3. Mẫu dương tính với hàn the C4 khi hơ trên dung dịch HCl
Kết quả kiểm tra định tính thu được sau thực nghiệm là:
25
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra định tínhSTT STT 1 2 3 4
Các mẫu bún, bánh giị, giò và chả ban đầu được thử sơ bộ cho kết quả là có 2 mẫu bánh giị (mẫu B2 và mẫu B4) , 5 mẫu giò (mẫu G1, G2, G3, G4, G5) và 3 mẫu chả (C1, C3, C4) làm giấy nghệ đổi sang màu đỏ cam. Khi hơ trên dung dịch NH3 thì giấy nghệ chuyển sang màu xanh và khi hơ trên axit clohydric giấy chuyển lại thành màu hồng.
Sau đó các mẫu thử sơ bộ cho kết quả dương tính được làm phép thử khẳng định để chắc chắn mẫu có chứa hàn the theo mục 2.3.1 thì tất cả 2 mẫu bánh giò, 5 mẫu giò và 3 mẫu chả được thử nghiệm sau khi các chất hữu cơ trong mẫu bị tro hóa để nguội thêm nước và thêm axit clohydric để dung dịch có tính axit rõ rệt. Tiếp theo dùng giấy nghệ nhúng vào dung dịch mẫu thử để khơ ở nhiệt độ phịng giấy nghệ chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam. Khi được hơ trên hơi amoni thì màu đỏ cam chuyển sang màu xanh đậm khi tiếp tục hơ trên khí clohydric thì giấy nghệ chuyển từ màu xanh đậm về màu hồng. Vậy từ phép thử sơ bộ và phép thử khẳng định cho ta kết quả định tính hàn the với các mẫu đã nghiên cứu cho thấy các mẫu bún trong giới hạn phát hiện của phương pháp thì khơng có mẫu nào chứa hàn the. Mẫu bánh giị có 2/5 mẫu dương tính với hàn the tức là chiếm 40% số mẫu. Mẫu chả cho kết quả 3/4 mẫu khảo sát chứa hàn the (75% mẫu chả dương tính) và tất cả mẫu giò được nghiên cứu 5/5 mẫu đều chứa hàn the.
Nhận xét: Như vậy kết quả định tính chỉ ra rằng có việc sử dụng hàn
the trong chế biến thực phẩm ở khu vực Đại học Quốc gia cụ thể 3/4 loại thực phẩm được định tính chứa hàn the, trong đó số mẫu dương tính chiếm 41,67%. Tỉ lệ mẫu chứa hàn the của mỗi loại cũng khác nhau cao nhất là giò
26
với 100% số mẫu, chả với 75% và bánh giò với 40% mẫu dương tính, khơng tìm thấy mẫu bún nào chứa hàn the.
3.2. Bán định lượng hàn the
Các mẫu chứa hàn the sau khi định tính cho kết quả dương tính sẽ được làm tiếp quá trình bán định lượng theo phương pháp tại mục 2.3.2 để xác định khoảng hàm lượng của hàn the có trong các mẫu. Sau khi nhúng giấy nghệ vào dung dịch thử và so sánh với dải màu của dung dịch chuẩn với 2 mẫu bánh giò B2, B4; 3 mẫu chả C1,C3,C4 và 5 mẫu giò G1,G2,G3,G4,G5 ta đọc kết quả:
- Màu của giấy nghệ nhúng dung dịch thử giống màu giấy nghệ nhúng dung dịch chuẩn nào thì hàm lượng tương đương với hàm lượng trong ống chuẩn đó.
- Màu giấy nghệ nhúng dung dịch thử không giống một giấy nghệ nhúng dung dịch chuẩn nào thì ta tìm khoảng màu. Giấy nghệ chứa dung dịch thử đậm hơn 1 giấy nghệ dung dịch chuẩn này nhưng lại nhạt màu hơn dung dịch chứa đung dịch chuẩn hàm lượng khác, 2 ống chuẩn này liên tiếp nhau (ví dụ ống 2 và ống 3; ống 5 và ống 6) thì hàm lượng hàn the của dung dịch thử sẽ nằm giữa khoảng của 2 dung dịch chuẩn đã biết trước hàm lượng.
- Nếu màu của giấy nghệ chứa dung dịch thử đậm hơn tất cả 9 ống chuẩn đã có thì cần pha lỗng mẫu thử rồi tiếp tục so màu như trên.
Hình 2.4. Dải màu giấy chuẩn trong bán định lượng hàn the
Đọc kết quả 10 mẫu nghiên cứu ta thu được kết quả hàm lượng của axit boric trong 10 ml dung dịch thử (tương ứng với 5 g) là:
27
Bảng 3.2. Kết quả bán định lượng sau khi so màu với dãy chuẩn
Mẫu
Bánh giò
Chả
Giò
Sau khi so màu của giấy nghệ nhúng mẫu thử và dãy giấy nghệ nhúng dung dịch chuẩn ta được kết quả như bảng trên. Đây là kết quả axit boric có trong 10 ml dung dịch thử có màu nằm trong khoảng màu của 10 ml hai dung dịch chuẩn liên tiếp.
Xác định nồng độ H3BO3 trong mẫu phân tích được tính theo cơng thức sau:
C=A/5*100 Trong đó:
C: Số mg H3BO3 trong 100 g mẫu phân tích.
A: Số mg H3BO3 trong 10 ml dung dịch ống chuẩn có màu bằng ống thử.
5: Lượng mẫu thực phẩm tương ứng với 10 ml dịch chiết dùng cho thử
nghiệm.
Áp dụng cơng thức ta thu được số mg H3BO3 có trong 100 g mẫu phân tích là:
28
Bảng 3.3. Kết quả bán định lượng hàm lượng H3BO3 trong mẫuMẫu Mẫu
Bánh giò
Chả
Giò
Như vậy, kết quả bán định lượng là bánh giò B2 và B4 chứa 10-20 mg H3BO3 trong 100 g mẫu phân tích; 3 mẫu chả thì 2 mẫu chứa 150-200 mg H3BO3, một mẫu chứa 200-500 mg H3BO3 trong 100 g mẫu phân tích; 5 mẫu giị trong đó 3 mẫu có 150-200 mg H3BO3, một mẫu chứa 200-500 mg H3BO3 và một mẫu chứa 500-1000 mg H3BO3 trong 100 g mẫu phân tích.
Nhận xét:
Kết quả bán định lượng hàn the cho ta thấy hàm lượng hàn the được sử dụng trong các loại thực phẩm và trong các mẫu rất đa dạng trong đó có thể thấy các mẫu giị là sử dụng hàm lượng hàn the trung bình là lớn nhất (240-
480mg) và chệnh lệch nhiều giữa các mẫu, hàm lượng hàn the được sử dụng nhỏ nhất là bánh giò (10-20 mg). Mẫu chả cũng được sử dụng khơng ít hàn the trung bình chung nằm ở khoảng giữa bánh giị và giò (167-300 mg).
3.3. Bàn luận
Kết quả định tính và bán định lượng cho thấy hàn the trong đa số mẫu bánh giò, chả và giò thu thập, khoảng hàm lượng rộng từ trên 10 mg/100 g (100 ppm) đến dưới 1000 mg/100 g (10.000 ppm).
Trong các mẫu bún được khảo sát trong giới hạn phát hiện của phương pháp không phát hiện ra hàn the trong mẫu nào khi tiến hành thí nghiệm. Bún là mẫu thực phẩm làm từ tinh bột sợi thường mềm nếu để ngồi mơi trường
29
bình thường bún để từ sáng đến chiều sẽ bị chua để bảo quản được lâu hơn thì cần bỏ bún vào tủ lạnh và trước khi sử dụng cần tráng qua nước sơi. Bún khi dùng hóa chất như hàn the thì rất khó để phát hiện bằng mắt thường bún được dùng hàn the sẽ làm tinh bột đặc hơn giúp sợi bún dai và giịn hơn, khi để ngồi mơi trường bình thường sợi bún sẽ cứng lại và ít bị chua đó là lý do một số nơi cho hàn the vào để sản xuất bún.
Trong các mẫu bánh giị có 2/5 mẫu ứng với 40% mẫu bánh giò chứa hàn the cho thấy bánh giò cũng là 1 sản phẩm được các cơ sở sản xuất đưa hàn the vào làm phụ gia thực phẩm. Hàn the sẽ giúp tinh bột trong bánh giò đặc và dai hơn và bảo quản lâu hơn. Nhưng hơn một nửa số mẫu bánh giị khơng phát hiện chứa hàn the và 2 mẫu phát hiện hàn the có kết quả bán định lượng khá thấp so với chả hay giò 10-20 mg trong 100 g thực phẩm cho thấy vẫn nhiều nơi sản xuất an toàn khơng dùng hàn the làm phụ gia trong bánh giị