Chƣơng 3 : NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.7.Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.7.Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các
chủng vi khuẩn S.suis phân lập đƣợc
Cách tiến hành:
- Chuẩn bị môi trƣờng thạch đĩa Muller Hiton;
- Vi khuẩn S. suis nuôi cấy trong môi trƣờng thạch TSA qua đêm. Các khuẩn lạc của các vi khuẩn đƣợc tạo huyền phù trong nƣớc muối sinh lý 0,9% để đƣợc độ đục tƣơng đƣơng ống McFarland 1 (3 x 108
25
dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên thạch đĩa Muller Hinton;
- Dùng máy tự động đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxioid (Anh) lên mặt đĩa thạch;
- Bồi dƣỡng đĩa thạch ở 37oC/18 - 24 giờ (5% CO2). Đọc kết quả bằng cách đo đƣờng kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra (bảng 3.3).
Bảng 2.5: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng
sinh (NCCLS - 2002) [29]
TT Loại
kháng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Mạnh Trung bình Kháng thuốc 1 Ceftiofur 30 µg ≥ 21 18 - 20 17 2 Ampicillin 10 µg ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 3 Amoxicillin 20 µg ≥ 20 - ≤ 19 4 Neomycin 30 µg ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 5 Amikacin 30 µg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 6 Gentamicin 10 µg ≥ 19 - ≤ 15 7 Lincomycin 15 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 8 Colistin 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 9 Tetracyclin 30 µg ≥ 29 26 - 28 ≤ 25 10 Erythromycin 15 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 11 Florfenicol 30 µg ≥ 23 - ≤ 20 3.4.7. Phƣơng pháp thử phác đồ điều trị
Căn cứ vào kết quả xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn
Streptococcus suis phân lập đƣợc, chúng tôi lựa chọn 3 loại thuốc kháng sinh
mẫn cảm cao, đang đƣợc phép lƣu hành tại Việt Nam. Kết hợp với các loại thuốc điều trị triệu chứng, trợ sức, trợ lực, xây dựng lấy 3 phác đồ và tiến hành thử nghiệm điều trị. Để đánh giá đƣợc hiệu quả một cách khách quan, các phác đồ đƣợc thực hiện có sự đồng đều tƣơng đối về các tiêu chí cơ bản sau:
- Số lợn mắc viêm phổi ở cùng một địa phƣơng đƣợc phân ra ngẫu nhiên làm 3 lô tƣơng ứng với 3 phác đồ điều trị bệnh;
26
- Đánh giá hiệu quả của các phác đồ điều trị căn cứ vào sự ổn định dần về hiện tƣợng ho, thở, tình trạng ăn, uống … sau 10 ngày kể từ khi dùng thuốc.
- Các phác đồ điều trị thử nghiệm lợn mắc bệnh nhƣ sau:
+ h c đồ 1: Điều trị nguyên nhân lợn mắc viêm phổi dùng thuốc kháng
sinh 1 do công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất (thành phần ceftiofur: 10g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng: 1ml/25 kg thể trọng ngày; tƣơng ứng là 4 mg ceftiofur/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 giờ (3 ngày tiêm 1 lần).
Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức, nâng cao sức đề kháng: GLUCO-K- CNAMIN, tiêm bắp với liều: 1ml/10 kg thể trọng/ngày (tiêm 1 lần/ngày).
+ h c đồ 2: Dùng thuốc kháng sinh 2 do công ty cổ phần thuốc thú y
Marphavet sản xuất (thành phần amoxicillin:15g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng 1 ml/10 kg thể trọng ngày; tƣơng ứng là 15 mg amoxicillin/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 48 giờ (2 ngày tiêm 1 lần).
Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức, nâng cao sức đề kháng: GLUCO-K- CNAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày (1 lần/ngày).
+ h c đồ 3: Dùng thuốc kháng sinh 3 do công ty cổ phần thuốc thú y
Marphavet sản xuất (thành phần florfenicol: 45g/100 ml), tiêm bắp với liều lƣợng 1 ml/30 kg thể trọng ngày; tƣơng ứng là 15 mg florfenicol/kg thể trọng; thuốc tác dụng kéo dài 72 - 96 giờ (3 ngày tiêm 1 lần).
Điều trị triệu chứng, trợ lực, trợ sức, nâng cao sức đề kháng: GLUCO-K- CNAMIN, tiêm bắp với liều: 1 ml/10 kg thể trọng/ngày (1 lần/ngày).
3.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu
Số liệu thu đƣợc trong các thí nghiệm đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê sinh học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel.
27
Chƣơng 4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus suis
Sau khi thu thập mẫu chúng tôi tiến hành phân lập vi khuẩn. Để phân loại đƣợc lợn khỏe và lợn có triệu chứng bệnh đƣờng hô hấp, căn cứ vào tình trạng sức khỏe của lợn, đặc biệt là dấu hiệu ho, thở của lợn khi còn sống. Sau đó tiến hành giết mổ lợn, lấy mẫu dịch họng và tổ chức phổi của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.1:
Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus suis
Đối tƣợng Loại bệnh phẩm Số mẫu kiểm tra (mẫu) Số mẫu dƣơng tính (mẫu) Tỷ lệ dƣơng tính (%) Tỷ lệ tính chung (%)
Lợn sau cai sữa (>1,5-3 tháng tuổi) Phổi 7 5 71,7 81,2 Dịch họng 9 8 88,8 Lợn thịt (>3-6 tháng tuổi) Phổi 8 4 50,0 64,3 Dịch họng 6 5 66,6 Tính chung 30 22 73,3
Qua bảng 4.1 cho thấy các loại lợn và vị trí lấy mẫu khác nhau tỷ lệ mắc bệnh viêm phổi do S.suis là khác nhau.
- Giai đoạn sau cai sữa tỷ lệ dƣơng tính ở phổi là 71,7% và ở dịch họng là 88,8%. Tỷ lệ nhiễm tính chung là 81,2%.
- Giai đoạn lợn thịt tỷ lệ dƣơng tính ở phổi là 50,0% và ở dịch họng là 66,6%. Tỷ lệ nhiễm tính chung là 64,3%
Nhƣ vậy ở vị trí phổi có tỷ lệ dƣơng tính thấp hơn ở dịch họng. Giai đoạn sau cai sữa có tỷ lệ nhiễm tính chung là 81,2% cao hơn giai đoạn lợn thịt. Theo chúng tôi tỷ lệ lợn mắc viêm phổi ở lứa tuổi sau cai sữa cao là do hệ thống thần
28
kinh chƣa hoàn chỉnh, điều kiện để thích nghi với ngoại cảnh yếu, dẫn tới sức đề kháng yếu so với yếu tố bên ngoài, đặc biệt khi thời tiết, khí hậu thay đổi, ảnh hƣởng đến sinh lý của lợn dẫn đến lơn dễ mắc bệnh hơn, còn ở giai đoạn lợn thịt tỷ lệ nhiễm thấp hơn (64,3%) là vì ở lứa tuổi này đặc điểm sinh lý của lợn đã hoàn thiện, khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi tốt hơn nên tỷ lệ mắc cũng thấp hơn.
4.2. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn
4.2.1. Kết quả xác định số loại khuẩn lạc từ mẫu bệh phẩm
Sau khi đem mẫu đi nuôi cấy trên môi trƣờng thạch máu, chúng tôi phân lập đƣợc 6 chủng vi khuẩn khác nhau. Kết quả thể hiện ở bảng 4.2:
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của những chủng phân lập đƣợc STT Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm vi khuẩn Hình que Hình trứng Gram + Gram - 1 Tròn lồi, bóng láng, óng ánh ,trắng 1 –
2mm không dung huyết hoàn toàn + +
2 Tròn, Nhám, trong, dung huyết hoàn
toàn kích thƣớc 0,8 - 0,9mm + +
3 Tròn lồi, bóng láng, óng ánh màu trắng
,1 - 2mm, không gây dung huyết + +
4 Tròn, gọn, trơn, mịn, nhỏ, sáng trắng,
dung huyết, kích thƣớc 0,9 - 1 mm + +
5 Tròn, gọn, trơn, sáng trắng, dung
huyết, kích thƣớc 0,9 - 1mm + +
6 Tròn, gọn, trơn, mịn, màu sáng trắng, không dung huyết, kích thƣớc từ 0,8 - 0,9mm
29
- Khuẩn lạc số 1 và 3 có dạng tròn, bóng, màu trắmg và óng ánh, khuẩn lạc 1 không gây dung huyết hoàn toàn, khuẩn lạc 3 gây không dung huyết, kiểm tra đặc điểm vi khuẩn thì 1 và 3 đều có hình trứng và bắt màu gram dƣơng . Khuẩn lạc 2 tròn, nhám, trong, dung huyết hoàn toàn, kiểm tra đặc điểm vi khuẩn cho kết quả bắt màu gram âm và có hình trứng.
Qua hình thái khuẩn lạc và đặc điểm của vi khuẩn có thể kết luận 3 khuẩn lạc này không phải khuẩn lạc của nhóm S.suis.
Trong đó có 3 loại khuẩn lạc 4, 5, 6 lạc tròn, gọn, mịn hoặc trơn, sáng trắng, dung huyết và khuẩn mọc tốt. Khi kiểm tra đặc điểm vi khuẩn thì thấy vi khuẩn có dạng hình trứng (oval), bắt màu gram dƣơng, xác định đây là khuẩn lạc của S.suis. Tiếp tục đem kiểm tra hình thái cho kết quả là dƣơng tính.
Hình ảnh 4.2: Hình thái vi khuẩn S. suis
Vậy dựa vào kết quả phân lập và kiểm tra hình thái có thể kết luận 3 khuẩn lạc 4, 5, 6 là khuẩn lạc của S.suis. Chúng tôi tiếp tục đem kiểm tra đặc tính nuôi cấy.
30
4.2.2. Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy vi khuẩn S.suis
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra đặc tính nuôi cấy vi khuẩn S.suis
Chỉ tiêu theo dõi
Đặc tính vi khuẩn Số mẫu kiểm tra (n=10) Số mẫu dƣơng tính (+) Tỷ lệ dƣơng tính (%) Bắt màu Gram + 10 10 100 Môi trƣờng thạch thƣờng Dạng S 10 10 100 Nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám 10 9 90 Môi trƣờng nƣớc thịt Hạt hoặc hạt bông 10 10 100 Lắng đáy 10 10 100
MacConkey Hình đầu đinh ghim, 10 10 100
Lồi, trắng trong 10 9 100
Dung huyết trên thạch máu
Không hoàn toàn (2 vòng)
10 1 10
Hoàn toàn 10 3 20
Không dung huyết 10 6 60
- Các chủng vi khuẩn S. suis đƣợc kiểm tra đều bắt màu Gram dƣơng, có
hình cầu, xếp thành các chuỗi có độ dài ngắn khác nhau. - Vi khuẩn mọc tốt trên môi trƣờng thạch thƣờng.
- Trên môi trƣờng nƣớc thịt, vi khuẩn hình thành hạt hoặc những bông, rồi lắng xuống đáy ống. Sau 24h môi trƣờng trong đáy có cặn.
- Vi khuẩn mọc tốt trên môi trƣờng MacConkey tạo thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim, lồi, trắng trong.
- Trên môi trƣờng thạch máu, vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc nhỏ, trắng trong, hơi lồi và gây dung huyết không hoàn toàn là 10% và hoàn toàn là 30%, không dung huyết là 60%.
Vậy các chủng đem phân lập cho kết quả phù hợp về đặc tính nuôi cấy của vi khuẩn S.suis, kết quả trên phù hợp với tài liệu Nguyễn Nhƣ Thanh và cs,
31
(2001) [15] đã đƣa ra. Chúng tôi tiếp tục cấy thuần các khuẩn lạc và chọn ra 10 khuẩn để thử phản ứng sinh hóa.
4.3. Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc bằng hệ thống API 20 Strep khuẩn S. suis phân lập đƣợc bằng hệ thống API 20 Strep
Tất cả 10 chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc sau khi đã đủ yêu cầu của
các phản ứng cấp I, tiếp tục đƣợc tiến hành kiểm tra qua các phản ứng cấp II là hệ thống định danh vi khuẩn Streptococcus gồm các phản ứng sinh hoá đã đƣợc chế sẵn, gọi là API 20 Strep. Hệ thống này thƣờng đƣợc dùng để xác định và phân biệt các loại vi khuẩn trong nhóm Streptococcus hoặc các vi khuẩn nhóm khác có các đặc tính sinh vật, hoá học tƣơng tự; gồm 20 phản ứng đã đƣợc chế sẵn trong một khay nhựa do hãng BioMérieux (Mỹ) sản xuất là: VP, HIP, ESC, PYRA, GAL, GUR, GAL, PAL, LAP, ADH, RIB, ARA, MAN, SOR, LAC, TRE, INU, RAF, AMD, GLYG.
32
Bảng 4.4: Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc bằng hệ thống API 20 Strep
TT Tên phản ứng Ký hiệu
phản ứng
Kết quả (n=10) Số chủng (+) Tỷ lệ (%)
1 Voges Proskauer VP 0 0
2 Thuỷ phân Hippuric acid HIP 1 10
3 Esculin ESC 7 70
4 Pyrrolidonyl Arylamidase PYRA 4 40
5 -Galactosidase GAL 8 80
6 -Glucuronidase GUR 8 80
7 -Galactosidase GAL 6 60
8 Alkaline Phosphatase PAL 1 10
9 Leucine Amino Peptidase LAP 10 100,0
10 Arginine Dihydrolase ADH 9 90
11 Ribose RIB 0 0 12 Arabinose ARA 0 0 13 Mannitol MAN 0 0 14 Sorbitol SOR 2 20 15 Lactose LAC 9 90 16 Trehalose TRE 8 80 17 Inulin INU 6 60 18 Raffinose RAF 9 90 19 Amidon AMD 9 90 20 Glycogen GLYG 8 80
Kết quả ở bảng 4.4 cho thấy có 100% số chủng vi khuẩn S. suis đƣợc kiểm tra đều cho kết quả âm tính trong phản ứng Voges Proskauer (VP) và không lên men các đƣờng ribose (RIB), arabinose (ARA). Các phản ứng khác, bao gồm:
33
phản ứng thủy phân acid Hippuric (HIP), Alkaline Phosphatase (PAL) và phản ứng lên men đƣờng sorbitol (SOR) thì chỉ có 1 đến 2 chủng có phản ứng dƣơng tính, chiếm tỷ lệ 60%; hầu hết các chủng đƣợc kiểm tra đều lên men các loại đƣờng raffinose (RAF), lactose (LAC), glycogen (GLYG), trehalose (TRE), amidon (AMD) với các tỷ lệ từ 80 đến 90%; phản ứng thủy phân (LAP) thì tất cả các chủng vi khuẩn S. suis đƣợc kiểm tra đều cho kết quả dƣơng tính, chiếm tỷ lệ 100%. Từ kết quả thu đƣợc cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc ở lợn dƣơng tính với viêm phổi tại tỉnh Thái Nguyên đều mang các đặc tính sinh vật, hóa học đặc trƣng của vi khuẩn S. Suis. Tƣơng đồng với mô tả của nghiên cứu nhƣ xác định đặc tính sinh vật, hóa học của 116 chủng vi khuẩn
S. suis phân lập đƣợc ở lợn tại các ổ dịch PRRS thuộc một số tỉnh Miền Bắc và
Trƣơng Quang Hải và cs (2012) [1] xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của 62 chủng vi khuẩn S. suis phân lập đƣợc ở lợn mắc viêm phổi. Các kết quả thu đƣợc đều cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn S. suis đƣợc kiểm tra đều âm tính với các phản ứng lên men các đƣờng glucose, galactose, lactose, maltose; 96,55% đến 96,77% số chủng lên men đƣờng trehalose và 100% các chủng vi khuẩn S. suis kiểm tra không lên men các đƣờng mannitol, sorbitol, mannit.
Vậy ta kết luận đây là vi khuẩn Streptococcus suis.
4.4. Kết quả thử phản ứng PCR
Để khẳng định chính xác mẫu khuẩn lạc nghi ngờ là S.suis gây bệnh viêm phổi cho lợn, chúng tôi tiến hành đem 1 mẫu khuẩn lạc để chạy phản ứng PCR, kết quả kiểm tra phƣơng pháp điện di cho ta thấy:
34
Bảng 4.5: Kết quả PCR
Điện di Tổng hợp kết quả PCR
Thời gian: 35 phút Mẫu Mồi Kết quả
Điện thế: 100 V
str 1
16ssF1/R1 +
Giếng M: 1 kb DNA ladder (1 µl 6X loading dye-NEB + 5 µl DNA ladder-NEB)
giếng 1 : sản phẩm PCR thu đƣợc sử dụng cặp mồi 16ssF1/R1 (1 µl 6x loading dye-NEB + 5 µl sản phẩm PCR).
giếng N: đối chứng âm của cặp mồi 16ssF1/R1 (Sản phẩm PCR không có DNA)
* Kích thƣớc SP PCR: 1500 bp
*Kết luận:
- Mẫu khuẩn lạc từ đĩa cấy chủng str 1 dƣơng tính với cặp mồi định danh S. Suis
Kết luận: Mẫu khuẩn lạc đều dƣơng tính với gene định danh CPS của vi khuẩn S.suis. Trùng khớp với kết quả phản ứng sinh hóa ở trên. Ta khẳng định đây là vi khuẩn S.Suis và tiếp tục thử kháng sinh đồ.
4.5. Kết quả xác định đƣợc triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra tại thực địa phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra tại thực địa
- Sau khi tiến hành phân lập, xác đinh đặc tính sinh hóa, chạy phản ứng PCR của vi khuẩn S.suis từ 30 mẫu đƣợc kết quả có 18 mẫu dƣơng tính với vi
M 1 N 2 kb \ 1,5 kb
35
khuẩn S.suis. Chúng tôi quay trở lại điều tra triệu chứng và bệnh tích của 18 mẫu lợn ở hai giai đoạn khác nhau và cùng bị viêm phổi do S.suis gây ra kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 4.6 và 4.7
Bảng 4.6: Kết quả xác định đƣợc triệu chứng điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra
Chỉ tiêu Triệu chứng Tổng số mẫu (con) Số con có biểu hiện Tỉ lệ (%) Lợn sau cai sữa (>1,5-3 tháng tuổi) Sốt, sốt nhẹ 10 10 100
Chảy nƣớc mắt, dịch mũi, giảm ăn hoặc bỏ ăn, tiêu chảy
10 10 100
Thở khó, thở nhan, đôi khi hóp bụng vào để thở. 10 10 100 Hạch hầu sƣng to niêm mạc ở những vùng da mỏng xuất huyết, tím bầm. 10 10 100 Chết đột ngột, có triệu chứng chảy máu mũi 10 2 20 Lợn thịt (>3-6 tháng tuổi) Sốt, sốt nhẹ 10 10 100
Bỏ ăn, hắt hơi, ho kéo dài, khó thở, thở hóp bụng, tiêu chảy, xù lông, mệt mỏi nằm 1 chỗ 10 10 100 Hạch hầu sƣng to niêm mạc ở những vùng da mỏng xuất huyết, tím bầm. 10 10 100 Chết đột ngột, có triệu chứng chảy