CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.4. Phương pháp phân tích hàm lượng hormone steroid huyết tương
Trong nghiên cứu này, E2, T và 11-KT trong huyết tương cá dìa được phân tích bằng phương pháp miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: ELISA). EIA Kit hormone steroid từ nhà sản xuất (Enzyme Immuno Assay: EIA) Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Phương pháp ELISA lợi dụng sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) để tạo thành cộng hợp kháng nguyên, kháng thể. Cộng hợp kháng nguyên – kháng thể này sẽ tiếp hợp với kháng thể thứ 2 được đánh dấu bằng enzyme Acetylcholinesterase (AChE). Phức hợp này sẽ được phát hiện bằng chất hiện màu (Ellman’s Reagent) và đo mật độ quang trên máy quang phổ 96 giếng (Thermo Multiskan EX, Hà Lan) ở bước sóng 405 nm.
Hình 2.4. Bộ KIT Estradiol, Testosterone và 11-KT ELISA
Phương pháp phân tích được tóm tắt theo trình tự các bước thực hiện như sau:
(1) Dung dịch đệm EIA (EIA buffer) và dung dịch rửa (Wash buffer): Hòa
tan 10 ml dung dịch đệm EIA đậm đặc với 90ml nước tinh khiết (Merck, Đức). Hòa tan 5ml dung dịch rửa đậm đặc với 2.000ml nước tinh khiết. Sau đó, hịa tan 1 ml Tween 20 vào dung dịch rửa này trước khi sử dụng. Bảo quản các dung dịch này ở nhiệt độ 40C.
(2) Mẫu huyết tương: Lấy 0,5 ml mẫu huyết tương hòa tan với 2,5 ml diethyl
ether và lắc đều trên máy Vortexer. Để yên trong khoảng 5-10 phút, hỗn hợp sẽ được tách biệt thành 2 lớp. Dùng pipet hút lấy phần dung dịch ở lớp trên trong suốt, đó là lớp ether có chứa hormone steroid, cho vào trong ống nghiệm mới và lập lại quy trình lần thứ 2 tương tự. Sau khi chiết xuất được phần ether có lẫn hormone steroid, cho bay hơi hết ether, hormone steroid còn lại sẽ lắng tụ ở đáy và thành của ống nghiệm. Đưa
0,5 ml dung dịch đệm EIA vào ống nghiệm và lắc đều, đảm bảo hòa tan được hormone steroid với dung dịch đệm EIA.
Hình 2.5. Máy ly tâm sử dụng trong nghiên cứu
(3) Hormone steroid chuẩn: Dùng pipet lấy 100 μl hormone steroid chuẩn trong bộ kit của nhà cung cấp cho vào ống nghiệm sạch. Sau đó hịa tan hormone steroid chuẩn này với 900 μl nước tinh khiết bằng máy lắc đảo Vortexer. Sau đó chuẩn bị 8 ống nghiệm sạch và đánh dấu từ 1 đến 8. Đưa 900 μl dung dịch đệm EIA vào ống nghiệm số 1 và 500 μl dung dịch đệm EIA vào các ống nghiệm 2 đến 8. Chuyển 100 μl hormone steroid chuẩn đã hòa tan vào ống nghiệm 1 lắc đều, sau đó lấy ra 500 μl đưa vào ống nghiệm 2 và lắc đều. Tiếp theo, lấy ra 500 μl từ ống nghiệm 2 và đưa vào ống nghiệm 3 và lắc đều. Tương tự như vậy, thực hiện cho đến ống nghiệm thứ 8. Cuối cùng ta có dung dịch chuẩn với 8 nồng độ khác nhau. Dung dịch đánh dấu (hormone steroid AchE Tracer) pha chế bằng cách hòa tan 100 dtn hormone steroid với 6mL EIA buffer. Kháng nguyên (hormone steroid EIA antiserum) cũng được pha chế bằng cách hòa tan 100 dtn hormone steroid antiserum với 6ml EIA buffer.
Bảng 2.1. Nồng độ các hormone steroid chuẩn (pg/ml)
Thứ tự 1 2 3 4 5 6 7 8
Estradiol 4000 1600 640 256 102,4 41,0 16,4 6,6
Testosterone 500 250 125 62,5 31,3 15,6 7,8 3,9
11-KT 250 125 62,5 31,3 15,6 7,8 3,9 1,95
(4) Phân tích mẫu: Dùng micropipet hút 50μl các dung dịch đã chuẩn bị (EIA
buffer, dung dịch chuẩn, mẫu, chất đánh dấu enzyme và kháng nguyên) đưa vào đĩa nhựa 96 giếng theo sơ đồ phân tích đã bố trí sẵn. Sau đó, đĩa nhựa được ủ trên máy lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng (25-280C) trong thời gian 1-2 giờ tùy theo từng loại hormone steroid cần phân tích. Tiếp theo, rửa sạch các giếng và đưa cơ chất (Ellman’s reagent) vào các giếng trên đĩa, tiếp tục ủ đĩa trong thời gian 60-90 phút. Cuối cùng, đo mật độ quang của các giếng trên đĩa nhựa ở bước sóng 405 nm trên máy quang phổ ELISA.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí các giếng
Blk (Blank): mẫu trắng, NSB (Non – Specific Binding): khơng có liên kết đặc trưng, Bo (Maximum Bingding): liên kết nhiều nhất, TA (Total Activity): tất cả mọi hoạt động, S1 – S8: dung dịch steroid chuẩn ở 8 nồng độ khác nhau, 1 - 24: mẫu cần phân tích.
Hình 2.8. Đĩa 96 giếng trước và sau khi ủ
(Blk: Blank; NSB: Non-Specific Binding; Bo: Maximim Binding; S1-S8: Standard 1-8; A4-H6: Samples)
Trình tự đưa các dung dịch đã chuẩn bị (ELISA buffer, dung dịch estradiol 17-β chuẩn, mẫu, ELISA Tracer, ELISA Antiserum) vào đĩa 96 giếng được tóm tắt như sau:
Bảng 2.2. Trình tự đưa dung dịch vào các giếng
Well ELISA buffer Standard/Sample Tracer Antiserum
Blk - - - -
TA - - 5 μl
(at devl. step)
-
NSB 100 μl - 50 μl -
Bo 50 μl - 50 μl 50 μl
Std/Sample - 50 μl 50 μl 50 μl
Sau đó, đĩa nhựa được ủ trên máy lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng (25-280C) trong thời gian 1 giờ. Tiếp theo, rửa sạch các giếng bằng dung dịch ELISA wash buffer 5 lần.
Dung dịch Ellman’s reagent được pha bằng cách hòa tan 20 ml nước cất với 100 dtn Ellman’s reagent. Sau khi rửa xong, đưa 200 μl cơ chất này (Ellman’s reagent) vào các giếng trên đĩa, và 5 μl ELISA Tracer vào giếng TA, tiếp tục ủ đĩa trong thời gian 60 phút. Cuối cùng, đo mật độ quang của các giếng trên đĩa nhựa ở bước sóng 405 nm trên máy quang phổ ELISA.
(5) Đường chuẩn và tính tốn kết quả: Đường chuẩn được xây dựng trên cơ
sở các nồng độ hormone steroid chuẩn (pg/ml) đã được chuẩn bị trước (X) và %B/Bo của các hormone steroid chuẩn (Y). Dựa vào phương trình Y = aLn(X) + b, hàm lượng hormone steroid trong mẫu được tính theo hàm số X = exp ((Y-b)/a).
Trong đó:
X là hàm lượng hormone steroid có trong mẫu Y là %B/Bo của mẫu
a và b là các hằng số
Hình 2.11. Đường chuẩn T
Hình 2.12. Đường chuẩn 11-KT