Các kỹ thuật ion hố trong đầu dị khối phổ ghép nối với phương pháp sắc ký được phát triển thành nhiều loại, thích hợp với tính chất đa dạng của các hợp chất. Trong nghiên cứu này, phương pháp GC sẽ tiến hành ion hoá bằng kỹ thuật Electron Impact (EI). Kỹ thuật phân tích khối là khối phổ hai lần, trong đó sử dụng một nguồn ion hoá ban đầu và hai bộ tách khối được liên kết bởi một vùng tạo ion thứ cấp.
Kỹ thuật EI được sử dụng để ion hố các hợp chất trung hồ và dễ bay hơi trong một buồng chân không, được gia nhiệt, thích hợp để kết nối với phương pháp GC. Các bộ phận cơ bản của EI được thể hiện ở Hình 1.4. Sự
ion hoá xảy ra dựa vào sự trao đổi năng lượng khi hợp chất va chạm với chùm tia electron được tạo ra từ filament được gia nhiệt. Chùm tia electron này có năng lượng vào khoảng 5 đến 100 eV và 70eV được xem là giá trị năng lượng chuẩn để ion hố mẫu cho việc ghi nhận tín hiệu khối phổ. Hầu hết các hợp chất hữu cơ sẽ bị ion hoá ở mức năng lượng từ 7 đến 20 eV nên nguồn năng lượng 70 eV sẽ đủ để tạo ra sự phân mảnh đối với các hợp chất đó. Ngoại trừ
các hợp chất có ái lực electron lớn và rất ít các ion âm bền được hình thành đối với kỹ thuật EI nên EI được xem là nguồn ion hố dương [22].
Hình 1.4: Sơ đồ điển hình của bộ phận ion hố EI
Các mảnh ion sau khi được tạo ra sẽ đi vào bộ phân tách khối để tiến hành tách các ion theo tỷ lệ m/z. Bộ phân tách khối dùng trong nghiên cứu này là tứ cực gồm bốn thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trống để các ion bay qua. Những ion có tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua bộ lọc này
Hai thanh trụ đối diện nhau được áp một thế bao gồm thế một chiều có độ lớn là U và thế xoay chiều Vcos( t), trong đó V là thế xoay chiều và là tần số. Độ lớn của thế áp vào sẽ là U+Vcos( t). Mỗi cặp luôn được áp thế trái điện tích với nhau, nhưng cùng độ lớn, nghĩa là một cặp trụ sẽ có thế +(U+Vcos( t)) (dấu “+” trên Hình 1.5) và cặp cịn lại là -(U+Vcos( t)) (dấu “-“ trên Hình 1.6) [23]. Các ion đi vào bộ tách khối sẽ dao động trong điện trường được tạo thành từ bốn thanh trụ. Chuyển động của nó phụ thuộc vào tỷ lệ m/z của bản thân ion, thế một chiều và xoay chiều cũng như tần số của thế xoay chiều và chỉ những ion có tỷ lệ m/z thích hợp mới có thể đi qua bộ tứ cực và tới được đầu dò. Những ion còn lại sẽ bị va đập với các thanh trụ và
hút ra ngoài. Kỹ thuật tứ cực được xem là đơn giản, chi phí thấp và dễ dành vận hành
Hình 1.5: Sơ đồ một bộ tách khối tứ cực
Để có thể phân tích cấu trúc và định lượng các hợp chất ở hàm lượng thấp trong một nền mẫu phức tạp, thiết bị tách khối với sự kết hợp của ba bộ tứ cực đã được phát triển (Hình 1.6). Trong đó, bộ tứ cực thứ nhất và thứ ba có khả năng chọn lọc ion, bộ tứ cực giữa sẽ có nhiệm vụ như phần tạo ra các ion thứ cấp từ những ion đi ra từ bộ tứ cực đầu tiên. Với khả năng này, bộ ba tứ cực sẽ cải thiện khả năng nhận biết chất phân tích do có được nhiều dữ liệu hơn về cấu trúc chi tiết hoặc các nhóm chức đặc trưng của từng hợp chất. Việc đi qua hai bộ tách khối cũng làm tăng số lượng ion thích hợp có được từ hợp chất phân tích, làm tăng tín hiệu đến đầu dị và cải thiện tín hiệu S/N (signal-to-noise) [22].
Hình 1.6: Cấu tạo cơ bản của một đầu dò khối phổ ba tứ cực
Mặc dù sắc ký lỏng (LC) không quá phổ biến để phân tích OCPs, nhưng nó được sử dụng trong trường hợp các hợp chất có độ bay hơi kém, độ phân cực cao và không ổn định nhiệt (Sannino và cộng sự, 2004). Các
detector thường được sử dụng trong kỹ thuật sắc ký lỏng là detector diode array (DAD), detector quang và detector khối phổ (MSD). Việc sử dụng pha động để phân tích hố chất BVTV trong kỹ thuật sắc ký lỏng bao gồm hỗn hợp acetonitrile (MeCN) – nước hoặc hỗn hợp methanol (MeOH) – nước. Một số OCPs có thể được xác định theo phương pháp sinh học (ELISA) hay phương pháp điện cực màng sinh học (Biosensor) hoặc theo phương pháp cực phổ. Tuy nhiên, các phương pháp này khó có thể xác định một hố chất BVTV cụ thể mà chỉ có thể xác định sự có mặt của một nhóm chất, do đó, thường sử dụng trong công tác sàng lọc, đánh giá sơ bộ.
Một số phương pháp phân tích cụ thể đã được các tác giả sử dụng để phân tích OCPs trong mẫu gạo. Được chúng tơi tóm tắt dưới Bảng 1.3 sau
đây:
Bảng 1.3: Một số phương pháp phân tích OCPs trong mẫu gạo
STT Cách tiến hành LOD/LOQ (µg/kg) Tài liệu tham khảo Chiết Làm sạch Phân tích
1 Chiết với dung mơi DCM
Làm sạch bằng cột nhồi Florisil, rửa giải bằng hỗn hợp n- hexan/axeton (4:1, v/v)
GC-MS LOD: 0,26-87 [24]
2 QuEChERS d-SPE với 375 mg PSA and 750 mg MgSO4 khan GC- MS/MS LOD: 0,1-7,0 LOQ: 0,4- 26,3 [25] 3 Chiết với axeton- metanol (1: 1, Làm sạch bằng cột nhồi hỗn hợp Al2O3 và than hoạt tính (15:1, GC- ECD LOD: 2- 5 [26]
STT Cách tiến hành LOD/LOQ (µg/kg) Tài liệu tham khảo Chiết Làm sạch Phân tích
v/v) và DCM w/w), rửa giải với DCM
4 QuEChERs d-SPE 50mg PSA, 300mg MgSO4 và 20mg GCB GC– MS-SIM LOQ: 2-50 [27] 5 Mẫu được trộn với Celite 545 và chiết dung môi nhanh (ASE) với ACN Làm sạch bằng cột chiết pha rắn Envi-18, Envi-Carb và Sep-Pak NH2, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi ACN/Toluene(3:1,v/v) GC-MS LOD: 0,5– 300 [28] 7 QuEChers 25 mL nước / ACN (1,5:1, v/v) và hỗn hợp muối MgSO4 / NaCl (4: 1, w / w) d-SPE với 150 mg PSA, 50mg C18 và 750 mg MgSO4 khan GC- TOF/MS [29]
Nhận xét phần nghiên cứu tổng quan: Từ các thơng tin và dữ liệu được trình bày phần tổng quan, học viên nhận thấy:
- Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu, cơng bố liên quan đến xây dựng phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật cơ clo trong gạo
- Phương pháp sắc ký khí khối phổ là phương pháp đã được nhiều nhà nghiên cứu lựa chọn với ưu điểm vượt trội về khả năng xác định chính xác đồng thời OCPs với độ nhạy cao trong các nền mẫu phức tạp.
- Trong nghiên cứu này, học viên lựa chọn kỹ thuật GC-MS/MS để xây dựng và phát triển quy trình phân tích đồng thời 19 OCPs trong mẫu gạo. Phương pháp này được xác nhận và đánh giá trước khi áp dụng để đánh giá dư lượng
của OCPs trong một số mẫu gạo. Kết quả của nghiên cứu này chính là cơ sở cho việc nghiên cứu xác định dư lượng của HCBVTV cơ clo trong gạo cũng
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ 2.1.1.1. Thiết bị 2.1.1.1. Thiết bị
* Thiết bị GC-MS/MS
- Hệ thống thiết bị sắc ký khí khổi phổ hai lần (Thermo Scientific, USA) bao gồm máy sắc ký khí (Trace 1300/1310), bộ phận bơm mẫu tự động (Triplus RSH) ghép nối với phần khối phổ TSQ 9000.
- Cột phân tích HP5-MS có chiều dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày lớp phim tráng là 0,25 m của Agilent (Mỹ).
* Các thiết bị khác
- Cân phân tích (độ chính xác 0,1mg) - Tủ sấy
- Máy cất nước khử ion - Thiết bị Votexer
- Thiết bị ly tâm Universal 320 (Hittich) - Bể siêu âm: Model S100H, hãng ELMA, Đức - Bộ chiết pha rắn: Model VM-12, hãng Agela, Mỹ - Bộ cơ khí Nito: Model DBG-002, hãng MRC Ltd, Israel
- Bộ ly tâm chân không: Model miVac Quattro, hãng SP Scientific, Mỹ
2.1.1.2. Dụng cụ
- Vial loại 2 ml
- Pipetman các loại từ 0-1000 µl và đầu típ tương ứng - Các bình định mức: 25, 50, 100ml
- Ống falcon 15, 50ml
- Các dụng cụ thông thường khác của phịng thí nghiệm
2.1.2. Hóa chất 2.1.2.1. Chất chuẩn 2.1.2.1. Chất chuẩn
- Hóa chất OCPs chuẩn 10 mg/L (10 ppm) là hỗn hợp Pesticide-mix 19 chuẩn dùng cho các phép đo sắc ký khí. Hỗn hợp chuần bao gồm: Alpha- HCH, Beta-HCH, Gamma-HCH, Delta-HCH, Heptachlor, Aldrin, Chlordane cis, α-Endosulfan, Chlordane trans, pp' DDE, Dieldrin, Endrin, β- Endosulfane, pp' DDD, Endrin Aldehyde, Endosulfane Sulfate, Endrin Keton, Methoxychlor. Dung dịch được bảo quản ở -20oC
2.1.2.2. Hóa chất
- N-hexan (Merck, Đức) - Toluene (Merck, Đức) - Axit axetic (Merck, Đức)
- MgSO4 khan, NaCl (Merck, Đức)
- Chất hấp phụ PSA (Primary secondary amine) (Agilent, Mỹ) - Chất hấp phụ C18 (Agilent, Mỹ)
2.1.2.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc nồng độ 1 mg/L: Lấy chính xác 1 mL dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 mg/L và định mức 10 mL với dung môi n- hexan. Dung dịch được bảo quản ở -20oC.
Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 µg/L được pha từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 mg/L trong dung môi n-hexan. Các dung dịch này chỉ được pha trước khi sử dụng.
2.1.2.4. Chuẩn bị mẫu chuẩn
- Mẫu dung dịch chuẩn: được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc và được sử dụng cho quá trình so sánh đánh giá hiệu suất thu hồi cũng như khảo sát các điều kiện chạy máy GC-MS/MS.
- Mẫu trắng: là mẫu gạo được xác định khơng có HCBVTV. Mẫu được làm khơ tự nhiên tại nhiệt độ phịng, nghiền và cho qua rây 2mm. Mẫu được bảo quản tại 4oC và được dùng làm nền cho các khảo sát quá trình chiết tách, làm sạch trên nền mẫu thật.
- Mẫu chuẩn trên nền trắng là mẫu được pha từ dung dịch chuẩn và dịch chiết của mẫu trắng theo quy trình xử lý mẫu dự kiến.
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.2.1. Tối ưu điều kiện phân tích trên hệ GC-MS/MS
Các nghiên cứu, khảo sát lựa chọn điều kiện vận hành thiết bị GC- MS/MS gồm:
- Nhiệt độ cổng bơm mẫu và tốc độ bơm mẫu, - Thể tích bơm mẫu và tốc độ khí mang
- Chương trình nhiệt độ
- Lựa chọn mảnh phân tách định tính và định lượng
Trong các khảo sát này, dung dịch chuẩn sẽ được đưa vào thiết bị GC- MS/MS với các điều kiện khảo sát khác nhau và từ đó lựa chọn ra điều kiện phù hợp nhất cho xây dựng qui trình phân tích.
2.2.2. Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu
Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu tập trung vào khả năng thu được tối đa chất phân tích ở dịch chiết cuối cùng, được thể hiện qua thông số độ thu hồi của chất phân tích. Để đạt mục đích trên, nghiên cứu tập trung tối ưu bốn thơng số của quy trình gồm: dung mơi chiết, q trình bay hơi dung mơi, loại chất hấp phụ được sử dụng ở bước làm sạch và thể tích dung mơi rửa giải. Trong quá trình xử lý mẫu, có khả năng cao xuất hiện các chất được chiết đồng thời với chất phân tích, tạo ra ảnh hưởng nền làm tăng hoặc giảm tín hiệu của OCPs ở hệ thống khối phổ. Để giảm thiểu ảnh hưởng nền đến kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu, độ thu hồi được tính theo hiệu suất phần trăm (%) giữa tín hiệu từ mẫu khảo sát trên tín hiệu mẫu chuẩn trên nền trắng. Mẫu khảo sát là mẫu được thêm chuẩn trước khi thực hiện quy trình xử lý mẫu theo thơng số cần khảo sát. Mẫu chuẩn trên nền trắng là mẫu được pha từ dung dịch chuẩn và dịch chiết của mẫu trắng gạo theo quy trình xử lý mẫu dự kiến.
2.2.2.1. Dự kiến quy trình xử lý mẫu
Để giảm thiểu hiệu ứng nền và tăng hiệu quả chiết thay vì kết hợp chiết xuất QuEChERS và làm sạch d-SPE thông thường, tôi lựa chọn SPE cho bước làm sạch dịch chiết. Dựa trên nghiên cứu xác định hóa chất BVTV trong chè của Lý Tuấn Kiệt và cơng sự [30], quy trình xử lý mẫu dự kiến xác định OCPs trên nền mẫu gạo như sau :
Bước 1. Cân 2 g mẫu gạo cho vào ống Falcon 50 mL.
Bước 2. Thêm 5ml nước deion và 10 mL ACN (1% axit axetic) và vào ống Falcon 50 mL. Lắc vortex trong 1 phút và lắc 30 phút.
Thêm muối EN 15662 QuEChERS (1g NaCl, 4 g MgSO4, 1g Na3Citrate, 0,5g Na2HCitrate)
Lắc vortex trong 1 phút.
Bước 3. Lấy ống Falcon ly tâm trong 10 phút với tốc độ 4500 vòng/phút.
Bước 4. Hút 5 mL dung dịch (lớp dung mơi phía trên) và cho đi qua cột được chiết pha rắn SPE để làm sạch
Bước 5. Rửa giải bằng 20ml ACN-Toluenen (3:1, v/v). Thu thập dung dịch chiết và dung dịch rửa giải
Bước 6. Ly tâm chân không dung dịch đến ~5 mL, sau đó làm khơ dưới dịng khí N2 ở nhiệt độ thấp. Hòa tan cắn trong 1 mL n-hexan rồi đem phân tích bằng GC-MS/MS.
Hình 2.2: Quy trình dự kiến xử lý mẫu phân tích OCPs
2.2.2.2. Lựa chọn dung môi chiết
Trong nghiên cứu này, mẫu được chiết theo phương pháp QuEChERS, vì vậy dung mơi acetonitrile (ACN) đã được chọn làm dung mơi chiết do có nhiều ưu điểm hơn so với các dung môi diclometan, n-hexan…Thứ nhất, acetonitrile có thể trộn lẫn với nước nhưng lại có thể tách lớp với nước khi cho thêm các muối như MgSO4. Thứ hai, acetonitril hạn chế hòa tan nhiều tạp chất như lipit hoặc protein, chất béo nên dịch chiết sẽ ít chịu ảnh hưởng
của nền mẫu [30, 31]. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng axit axetic cải thiện đáng kể hiệu quả chiết xuất trong phân tích đa dư lượng HCBVTV đồng thời việc bổ sung axit axetic vào MeCN giúp tăng cường tính ổn định của một số loại hố chất trừ sâu [32, 33]. Đồng thởi đối với nền mẫu có hàm lượng nước như ngũ cốc cần được bổ sung nước đảm bảo hiệu quả chiết [28]. Do đó, ba loại dung mơi khác nhau được lựa chọn để đánh giá hiệu quả chiết xuất: (i) 10 mL ACN, (ii) 5 mL nước và 10 mL ACN và (iii) 5 mL nước và 10 mL ACN (1% axit axetic).
2.2.2.3. Lựa chọn chất hấp phụ SPE
So với trái cây và rau quả, gạo đại diện cho nền khơ với thành phần chính là tinh bột nhưng tỷ lệ nhỏ bao gồm các hợp chất như axit béo, lipid, xơ, khống chất và protein lại gây khó khăn cho việc phân tích sắc ký. Do đó, việc sử dụng vật liệu hấp thụ một cách thích hợp trong giai đoạn làm sạch sẽ giúp giảm thiểu hiệu ứng chất nền và kéo dài tuổi thọ của cột sắc ký.
Trong chiết xuất QuEChERS, các chất hấp phụ thường được sử dụng trong gồm: C18, PSA (Primary and secondary amine), GCB (graphite carbon black). PSA là một chất hấp phụ trao đổi anion yếu trên nền silicagel dùng để hấp phụ các axit béo và cacbohydrat. C18 hấp phụ tốt đối với các chất không phân cực như chất béo, sáp, đừờng, tinh bột và không ảnh hưởng (hấp phụ) với phần lớn các HCBVTV. GCB được sử dụng để loại màu, chlorophyll và carotenoid. Tuy nhiên GCB lại có khả năng hấp phụ các hóa chất BVTV có cấu trúc phẳng như HCH [34, 35]. Trên cơ sở tính chất của các chất hấp phụ kết hợp với tính chất của nền mẫu, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kết hợp hai chất hấp phụ là C18 và PSA.
2.2.2.4. Khảo sát quá trình bay hơi dung môi
Phương pháp thêm chuẩn được sử dụng để đánh giá hiệu quả thu hồi từ q trình bay hơi dung mơi. Dung dịch chuẩn hỗn hợp OCPs (50 μL, 1 mg/L) được thêm vào 25 mL (5 mL ACN chứa 1% AA và 20 mL ACN/toluen, 3/1, v/v). Làm bay hơi dung môi cho đến khi thể tích cịn lại là 1ml (EC-A) hoặc bay hơi hồn tồn dung mơi (mẫu khô) (EC-B).