CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN
1.4.1. Sắc ký trao đổi ion
Lectin cĩ bản chất protein nên phân tử của nĩ mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của mơi trƣờng mà lectin mang điện tích dƣơng hoặc âm. Lợi dụng tính chất này ngƣời ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhĩm chứa ion tích điện dƣơng nhƣ DEAE- sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhĩm chức ion tích điện âm nhƣ CM- sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi chất trao đổi ion đều cĩ khả năng trao đổi một lƣợng ion nhất định gọi là dung lƣợng trao đổi. Ngƣời ta cĩ thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hĩa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện mơi trƣờng pH nhất định.
1.4.2. Sắc ký ọc ge
Đây là phƣơng pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thƣớc phân tử. Chất nhựa thƣờng đƣợc sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex cĩ bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lƣới xốp. Cĩ nhiều loại Sephadex, trong đĩ mỗi loại cĩ mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thƣớc của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất cĩ kích thƣớc phân tử
khác nhau. Để tinh chế lectin, ngƣời ta thƣờng dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100.
Phƣơng pháp sắc ký lọc gel cịn đƣợc dùng để xác định khối lƣợng phân tử của chất cần tách.
1.4.3. Sắc ký ái ực
Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) đƣợc gắn vào một chất nền tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất nhựa đƣợc sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực đƣợc tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.
+ Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp cĩ ái lực đặc hiệu với lectin cần tách cĩ ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của lectin cần tách, đặc tính lý hĩa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa lectin và chất kết hợp. Trong các thí nghiệm tinh chế lectin ngƣời ta thƣờng lựa chọn các chất đƣờng, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đƣờng cĩ ái lực hĩa học với một lectin nhất định.
+ Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất khơng cĩ ái lực với cột: Các lectin cĩ ái lực với cột cần đƣợc tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein khơng cĩ ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
+Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ cĩ ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dịng chảy.