CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ,cừu, gà và các nhĩm máu ngƣời A, B, O) : cừu, gà và các nhĩm máu ngƣời A, B, O) :
Mỗi mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl 0,15 M. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M cĩ chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 và đƣợc dùng nhƣ hồng cầu tự nhiên [13].
Hồng cầu các mẫu máu đƣợc xử lý enzyme tripsin hay papain đƣợc 1
chuẩn bị nhƣ sau: 10 thể tích của dung dịch trypsin hay papain 0,5 % (w/v) đƣợc thêm vào huyền phù các mẫu máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và đƣợc ủ ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hịa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M cĩ
chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu đƣợc huyền phù hồng cầu các mẫu máu 2 % đã xử lý enzyme trypsin hay papain [13].
2.3.2. Phân tích hoạt tính ectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhĩm máu ngƣời A, B, O).
Hoạt tính của lectin đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu [13].
Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin đƣợc thực hiện trong đĩa 96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm photphat 0,02 M cĩ chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha lỗng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ
1
pha lỗng là 2n (n: số lần pha lỗng) và giữ ở nhiệt độ phịng trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đĩ, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các giếng, lắc nhẹ nhàng hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ. Đọc kết quả.
Kết quả dƣơng tính đƣợc thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.
Hoạt tính của lectin (HU/mL) đƣợc thể hiện nhƣ là một tiêu chuẩn, và là giá trị nghịch đảo của độ pha lỗng lớn nhất mà dịch chiết lectin cịn cĩ khả năng làm ngƣng kết hồng cầu cho vào phản ứng.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần đối với mỗi loại hồng cầu đƣợc thử nghiệm.
Hoạt tính lectin: đƣợc xác định theo 2 chỉ số:
-Hoạt tính tổng (Utổng): là tổng số đơn vịhoạt tính cĩ trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU
Utổng = V. 2n Trong đĩ: V: tổng thể tích (mL)
n: số lần pha lỗng
Đơn vị: HU/mg U riêng U tổng Pr oteintổng
Trong đĩ: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính.
Proteintổng: tổng hàm lƣợng protein.
MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất cĩ khả năng gây ngƣng kết hồng cầu đã đƣợc xử lý enzyme. Đơn vị : µg/mL
MAC Hàm lượng protein
HA
2.3.3. Xác định hàm ƣợng protein.
Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp của Lowry và cộng sự [130], dùng albumin huyết thanh bị (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.
* Nguyên tắc
Trong mơi trƣờng kiềm, ion Cu2+ tạo thành phức chất với các liên kết peptide trong protein, khi đĩ nĩ bị khử thành ion Cu+. Ion Cu+ và các gốc của Tyrosine, Tryptophan và Cysteine phản ứng với thuốc thử Folin để tạo ra một sản phẩm khơng bền rồi bị khử thành molipden/vonfram xanh. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Đo cƣờng độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bƣớc sĩng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) cĩ thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein ở nồng độ vài chục µg.
* Hĩa chất
-Dung dịch A: 4 gam NaOH (0,1 M) và 20 gam Na2CO3 2 % pha trong 1000 mL nƣớc cất.
- Dung dịch B: 0,5 gam CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Natri Xitrat (1 %) hoặc trong dung dịch Natri – Kali Tactrat 1 %.
- Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha trƣớc khi sử dụng.
Ghi chú: Thuốc thửFolin, pha lỗng 2 lần với nƣớc cất trƣớc khi sử dụng. - Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bị (BSA) 1mg/mL.
* Các bƣớc tiến hành
- Cân 10 mg BSA hịa tan trong 10 mL nƣớc cất, thu đƣợc dung dịch gốc cĩ nồng độ 1 mg/mL.
- Sau đĩ, pha lỗng dung dịch gốc bằng nƣớc cất thành các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µg/mL để tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn.
-Lấy chính xác 0,5 mL dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đĩ 2,5 mL dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút. -Sau đĩ, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 mL thuốc thử Folin đã pha lỗng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút.
-Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bƣớc sĩng 750nm. Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đƣờng hồi quy. Kết quả đƣợc xử lý theo phƣơng pháp thống kê thơng thƣờng. Mẫu thí nghiệm cũng đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ đã nêu trên. Sau đĩ, đem so màu ở bƣớc sĩng 750nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA (Phụ lục 1) để tính hàm lƣợng protein trong các mẫu.
2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm:Bã Bã Dịch Cặn Rong H. eucheumatoides Xử lý Chiết Lọc, ly tâm thu dịch Kết tủa dịch chiết
Ly tâm, thu tủa Hịa tan tủa, thẩm tách Ly tâm, thu dịch trong
Sắc ký trao đổi ion
Thu các phân đoạn cĩ lectin cơ đặc
Sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200
Điện di SDS - PAGE
Lectin
Khảo sát điều kiện chiết:
-Dung mơi chiết.
-Tỷ lệ nguyên liệu: dung mơi chiết (w/v).
-Thời gian chiết (giờ).
Khảo sát: Nồng độ ethanol C2H5OH (%). Xác định: -Đặc tính liên kết cacbohiđrat -Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính Lectin: pH, nhiệt độ, …
-Khả năng gây ngƣng kết hồng cầu. -Điện di SDS-Page, xác định:
+Độ tinh sạch của lectin thu nhận đƣợc
+Trọng lƣợng phân tử của Lectin thu đƣợc
Mơ tả sơ đồ:
Rong đỏ H. eucheumatoides sau khi thu về đƣợc rửa sạch, tiến hành xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox cĩ bổ sung nitơ lỏng. Cho rong đã xay vào túi nilon và bảo quản trong tủ đơng -20 oC để chuẩn bị cho các thí nghiệm sau này.
Quá trình chiết lectin đƣợc thực hiện trong các điều kiện tối ƣu nhƣ: tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi, nồng độ dung mơi, thời gian chiết. Dịch chiết thơ đƣợc lọc bằng túi vải, tiến hành ly tâm 6.000 vịng/phút trong 15 phút để loại bỏ cặn bã.
Thêm ethanol với nồng độ thích hợp vào dịch chiết để kết tủa lectin. Sau khi tủa, tiến hành ly tâm dịch tủa ở 6.000 vịng/phút trong 30 phút. Loại bỏ dịch trong. Dùng lƣợng đệm ít nhất để hịa tan kết tủa. Dịch tủa sau đĩ đƣợc thẩm tách, rồi tiến hành ly tâm ở 6.000 vịng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong. Đây chính là chế phẩm của lectin.
Tiến hành tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose, thu các phân đoạn cĩ hoạt tính ngƣng kết hồng cầu, cơ đặc dịch trong bằng màng siêu lọc kích thƣớc 10 kDa. Thẩm tách để loại muối. Tiếp tục tinh chế lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200, thu các phân đoạn cĩ hoạt tính, cơ đặc, thẩm tách trong nƣớc cất để tiến hành các thí nghiệm sau.
Lectin thu đƣợc sau sắc ký lọc gel đƣợc dùng để khảo sát một số tính chất lý hĩa nhƣ: ảnh hƣởng của nhiệt độ, ảnh hƣởng của pH, ảnh hƣởng của cation hĩa trị 2 hay EDTA, đặc tính liên kết cacbohidrat; cũng nhƣ dùng để đánh giá độ tinh sạch, xác định khối lƣợng phân tử của lectin bằng phƣơng pháp điện di.
2.3.5. Phân tích các điều kiện tối ƣu để chiết ectin từ rong đỏ H. Eucheumatoides
Nguyên tắc chung:
Khi tiến hành phân tích một yếu tố nhất định trong quá trình tách chiết nhƣ: tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi chiết, nồng độ dung mơi, thời gian
chiết,…thì khi đĩ sẽ cố định các yếu tố khác và tiến hành thay đổi yếu tố chúng ta đang phân tích. Yếu tố nào phân tích xong thì sẽ đƣợc cố định ở giá trị tối ƣu để tiếp tục phân tích ảnh hƣởng của các yếu tố cịn lại. Với mỗi yếu tố phân tích, khi giá trị hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của lectin đạt giá trị cực đại thì đĩ là điều kiện tối ƣu đối với yếu tố chúng ta đang phân tích.
2.3.5.1. Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi chiết
Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, tiếp tục cho vào dung dịch ethanol 20 % với các tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi (w/v): 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, giữ ở 4 oC trong 6 giờ. Sau đĩ lọc thơ qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thơ (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).
Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng của từng dịch chiết thơ. Phân tích, so sánh và chọn ra tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi chiết (w/v) thích hợp nhất.
2.3.5.2. Phân tích nồng độ ethanol chiết
Cân khoảng 5 gam rong đã xay cho vào các ống Falcon, thêm tiếp dung mơi etanol với các nồng độ khác nhau 10 %; 20 %; 30 %; 40 %, với tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi (w/v) thích hợp, giữ các ống này ở 4 oC trong 6 giờ. Sau đĩ lọc thơ qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thơ (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).
Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của từng dịch chiết thơ. Phân tích, so sánh và chọn ra nồng độ dung mơi chiết thích hợp.
2.3.5.3. Phân tích thời gian chiết
Cho vào các ống Falcon rong đã xay với tỷ lệ nguyên liệu:dung mơi tối ƣu, thêm tiếp dung mơi ethanol cĩ nồng độ tối ƣu, giữ ở 4 oC và trong các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8, 10, 12 (giờ). Sau từng khoảng thời gian 2, 4, 6,…(giờ), tiến hành lọc sản phẩm qua túi vải rồi ly tâm với tốc độ
6000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thơ (mỗi mẫu đƣợc tiến hành 3 lần lặp lại).
Xác định hàm lƣợng protein, hoạt tính tổng số và hoạt tính riêng của từng dịch chiết. Phân tích, so sánh và chọn ra thời gian chiết thích hợp.
2.3.6. Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa ectin từ dịch chiết.
Tiến hành phân tích khả năng tủa lectin từ dịch chiết thơ bằng tác nhân tủa là ethanol ở các nồng độ khác nhau.
Trƣớc hết cần xác định thể tích dịch chiết thơ của lectin, sau đĩ tính tốn theo cơng thức (*) để xác định thể tích ethanol tuyệt đối (đƣợc giữ lạnh ở -20
oC) cần thêm vào dịch chiết để sau khi trộn nồng độ của ethanol cĩ các giá trị khoảng 50%, 60%, 70%, 80%. Tiến hành trộn và giữ lạnh ở 4 oC qua đêm.
Phần kết tủa sẽ đƣợc thu lấy và ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút trong 20 phút ở 4 oC. Kết tủa đƣợc rửa 3 lần với cồn tuyệt đối (giữ lạnh ở -20 oC) và ly tâm ở 6000 vịng/phút trong 20 phút ở 4 oC
(Các thí nghiệm đƣợc tiến hành 3 lần và lấy giá trị trung bình).
Cơng thức xác định nồng độ ethanol dùng để kết tủa lectin ứng với thể tích 1,0 lít:
y 1000(y x) (mL) [131] (100 x)
Trong đĩ: x: nồng độ ethanol trong dịch chiết thơ. y: nồng độ ethanol thu đƣợc sau khi trộn.
100: nồng độ ethanol tuyệt đối (thực tế nồng độ ethanol tuyệt đối chỉ đạt 96o)
Kết tủa lectin thu đƣợc đƣợc hịa với dung dịch đệm photphat 0,02 M khơng muối, pH= 7,5 (lƣợng ít nhất) để đƣa về cùng thể tích. Sau đĩ, tiến hành xác định hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng, từ đĩ chọn ra nồng độ tủa thích hợp.
2.3.7. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose
* Nguyên tắc: Nhựa DEAE – Sepharose là nhựa trao đổi anion yếu. Hỗn hợp mẫu qua cột sắc ký chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện tích âm khác nhau, do đĩ, khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau. Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trƣớc, cịn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn.
*Quy trình chạy sắc ký trao đổi ion: Lectin từ dịch chiết sau khi kết
tủa đƣợc thẩm tách trong dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0. Phần dịch trong đƣợc tiến hành chạy qua cột sắc ký trao đổi ion, dùng pha động là dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, pH = 9,0 (loại khí) để rửa giải các protein khơng liên kết và các chất màu, đến khi đo đƣợc A280nm gần bằng 0. Lectin sẽ đƣợc rửa giải bằng dung dịch đệm cacbonat 0,02 M cĩ chứa NaCl 0,5 M, pH = 9,0, thu các phân đoạn. Tiến hành đo A280nm, xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của các phân đoạn, từ đĩ thu nhận các phân đoạn cĩ hoạt tính và tiến hành cơ đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa. Vẽ đồ thị biểu
diễn sự tƣơng quan giá trị A280 nm, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu và thứ tự các phân đoạn.
Các thơng số đƣợc thiết lập trong quá trình chạy sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose:
- Nhựa trao đổi ion DEAE – Sepharose - Kích thƣớc cột: 1,6 x 20 cm
- Pha động: dung dịch đệm cacbonat 0,02 M; pH = 9,0 (loại khí); dung dịch đệm cacbonat 0,02 M, cĩ chứa NaCl 0,5 M, pH = 9,0 (loại khí).
- Thể tích mẫu: 10 mL - Tốc độ dịng: 10 mL/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 5 mL/phân đoạn - Số lƣợng phân đoạn: 54 phân đoạn.
2.3.8. Tinh sạch ectin bằng phƣơng pháp sắc ký ọc ge Sephacry S– 200.
* Nguyên tắc: Sephacryl S-200 là gel agarose cĩ khả năng phân tách
những protein cĩ kích thƣớc từ 5,0.103 – 2,5.105 Da. Do đĩ, khi cho dịch chiết chứa protein qua cột, những chất cĩ kích thƣớc lớn đi len lõi ở bên ngồi các hạt gel, di chuyển nhanh và ra ngồi trƣớc; trong khi đĩ những phân tử cĩ kích thƣớc nhỏ thì bị hấp thụ vào bên trong lỗ gel nên di chuyển chậm, ra khỏi cột sau.
* Quy trình chạy sắc ký lọc gel: Dịch thu đƣợc sau khi chạy sắc ký
trao đổi ion DEAE-sepharose cĩ hoạt tính ngƣng kết hồng cầu đƣợc cơ đặc bằng màng siêu lọc cĩ kích thƣớc cỡ 10 kDa, sau đĩ tiến hành thẩm tách trong đệm photphat 0,05M cĩ chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 ở 4 oC (để qua đêm) để cân bằng nồng độ muối và pH.
Tiến hành tinh sạch lectin bằng cách bơm mẫu vào cột sắc ký, sử dụng pha động là dung dịch đệm photphat 0,05M cĩ chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 (loại khí), rửa giải một thể tích cột, thu các phân đoạn. Sau đĩ đo A280nm và xác định hoạt tính ngƣng kết hồng cầu của từng phân đoạn. Thu nhận các phân đoạn cĩ hoạt tính và cơ đặc nồng độ dịch thu đƣợc bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa.
Vẽ đồ thị biểu diễn sự tƣơng quan giá trị A280nm, hoạt tính ngƣng kết hồng cầu và thứ tự các phân đoạn.
* Các thơng số kỹ thuật đƣợc thiết lập khi tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel: - Gel: Sephacryl S – 200
- Kích thƣớc cột: 1x30cm
- Pha động: dung dịch đệm photphat 0,05M cĩ chứa NaCl 0,15M, pH = 7,0 (loại khí)
- Thể tích mẫu: 1,0 mL - Tốc độ dịng: 0,8 mL/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 2,5 mL/phân đoạn - Số lƣợng phân đoạn: 52 phân đoạn.
2.3.9. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối ƣợng phân t ectin bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE [132]
Nguyên tắc: Điện di là sự di chuyển các chất mang điện tích trong điện trƣờng, tốc độ di chuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng và kích thƣớc của chất đĩ.
SDS – PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel