Lectin cĩ bản chất protein nên phân tử của nĩ mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của mơi trƣờng mà lectin mang điện tích dƣơng hoặc âm. Lợi dụng tính chất này ngƣời ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhĩm chứa ion tích điện dƣơng nhƣ DEAE- sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhĩm chức ion tích điện âm nhƣ CM- sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi chất trao đổi ion đều cĩ khả năng trao đổi một lƣợng ion nhất định gọi là dung lƣợng trao đổi. Ngƣời ta cĩ thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hĩa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện mơi trƣờng pH nhất định.
1.4.2. Sắc ký ọc ge
Đây là phƣơng pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thƣớc phân tử. Chất nhựa thƣờng đƣợc sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex cĩ bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lƣới xốp. Cĩ nhiều loại Sephadex, trong đĩ mỗi loại cĩ mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thƣớc của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất cĩ kích thƣớc phân tử
khác nhau. Để tinh chế lectin, ngƣời ta thƣờng dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100.
Phƣơng pháp sắc ký lọc gel cịn đƣợc dùng để xác định khối lƣợng phân tử của chất cần tách.
1.4.3. Sắc ký ái ực
Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) đƣợc gắn vào một chất nền tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất nhựa đƣợc sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực đƣợc tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.
+ Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp cĩ ái lực đặc hiệu với lectin cần tách cĩ ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của lectin cần tách, đặc tính lý hĩa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa lectin và chất kết hợp. Trong các thí nghiệm tinh chế lectin ngƣời ta thƣờng lựa chọn các chất đƣờng, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đƣờng cĩ ái lực hĩa học với một lectin nhất định.
+ Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất khơng cĩ ái lực với cột: Các lectin cĩ ái lực với cột cần đƣợc tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein khơng cĩ ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
+Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ cĩ ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dịng chảy.
1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEINDỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG
Phƣơng pháp khối phổ hay phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass spectrometry – MS) là một kỹ thuật dùng để xác định tỉ lệ khối lƣợng/điện tích (m/z). Phƣơng pháp phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, ví dụ trong hĩa học phƣơng pháp này cĩ nhiều ứng dụng quan trọng nhƣ: xác định phân tử khối khối phổ, nhận biết các chất cùng với cơng thức cấu trúc của chúng, xác định cơng thức cấu trúc của phân tử. Phƣơng pháp này cĩ khả năng phát hiện ra các hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10-12 đến 10-6 gam.
1.5.1. Nguy n tắc chung
Khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dịng electron cĩ năng lƣợng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra 1 hay 2 electron, khi đĩ nĩ trở thành các ion mang điện tích : +1, +2 (trong đĩ ion cĩ điện tích +1 chiếm tỉ lệ lớn).
ABC + e ABC+ + 2e (1) ABC+2 + 3e (2) Ion (1) đƣợc gọi là ion gốc hay ion phân tử.
Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dịng electron cĩ năng lƣợng cao thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, tạo nên các gốc hoặc các phân tử trung hịa khác nhau. Quá trình này đƣợc gọi là quá trình phân mảnh (fragmentation).
ABC+ A+ + BC ABC+ AB+ + C
A++B
Năng lƣợng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30 – 100 eV, cao hơn năng lƣợng ion hĩa phân tử (8 – 15 eV).
Các ion cĩ khối lƣợng m và điện tích e. Tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đĩ tách các ion cĩ số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất cĩ mặt của chúng. Tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa xác suất cĩ mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z, đồ thị thu đƣợc chính là phổ khối lƣợng [127]
Từ vị trí của các peak phân tử đọc đƣợc trên phổ khối lƣợng ta sẽ biết đƣợc số khối của phân tử hay cịn gọi là phân tử khối khối phổ.
1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân t khối của protein
Lectin cĩ bản chất là protein hoặc glycoprotein, chúng là các polyme đƣợc tạo thành từ sự kết hợp của 20 loại α-amino axit thơng qua các liên kết peptide. Dƣới tác dụng của các tác nhân, lectin sẽ bị phân cắt thành các chuỗi peptide ngắn hơn. Ví dụ: xian bromua (BrCN) cĩ khả năng phân cắt mạch peptit sau gốc Methionin (Met); hoặc enzyme Tripsin cĩ khả năng phân cắt liên kết sau gốc Lysin (Lys) và Arginin (Arg), emzyme Chimotripsin cĩ khả năng phân cắt liên kết sau gốc Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Leuxin (Leu), Axit aspactic (Asp), Axit glutamic (Glu) và Trytophan (Trp),.... Sau khi các chuỗi peptide đƣợc tinh chế, tiến hành cho mẫu vào máy phân tích khối phổ, thu khối phổ đồ. Từ đĩ xác định phân tử khối của protein.
1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONGLECTIN LECTIN
Trình tự các axit amin trong protein nĩi chung cũng nhƣ lectin nĩi riêng đƣợc xác định theo phƣơng pháp thối biến Edman [128], phƣơng pháp này đƣợc phát triển bởi Pehr Edman, đây là một phƣơng pháp xác định trình tự các axit amin trong chuỗi peptide. Trong phƣơng pháp này, gốc axit amin đầu cuối (đầu N) đƣợc đánh dấu và tách khỏi peptide mà khơng làm phá vỡ liên kết peptide giữa các gốc axit amin khác.
Cơ chế của phản ứng:
Phenyl isothiocyanate phản ứng với nhĩm –NH2 của axit amin đầu N khơng mang điện tích, trong mơi trƣờng kiềm nhẹ tạo thành dẫn xuất phenylthiocarbamoyl. Tiếp đến, trong mơi trƣờng axit, dẫn xuất này bị phân cắt thành dẫn xuất thiazolinone. Sau đĩ, axit amin thiazolinone đƣợc chiết với dung mơi hữu cơ thích hợp và đƣợc xử lý bằng axit để tạo thành phenylthiohydantoin (PTH) ổn định hơn – dẫn xuất axit amin cĩ thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký hoặc điện di. Quá trình này đƣợc lặp lại một lần nữa để xác định axit amin tiếp theo. Chiều dài chuỗi peptide bị hạn chế do quá trình tạo dẫn xuất khơng phải lúc nào cũng hình thành hồn chỉnh. Vấn đề tạo dẫn xuất cĩ thể đƣợc giải quyết bằng cách tách các peptide lớn thành các peptide nhỏ hơn trƣớc khi tiến hành phản ứng. Phƣơng pháp này cĩ khả năng sắp xếp chính xác đến 30 axit amin. Ƣu điểm lớn của phƣơng pháp suy thối Edman là phản ứng chỉ cần sử dụng 10 – 100 pico-mol peptide cho quá trình xác định trình tự chuỗi peptide.
Hạn chế của phương pháp suy thối Edman:
Vì sự thối biến Edman bắt nguồn từ đầu N của protein nên nĩ sẽ khơng hoạt động nếu đầu N đã bị biến đổi hĩa học (ví dụ nhĩm –NH2 bị acetyl hĩa hoặc hình thành axit pyroglutamic). Trình tự sẽ dừng lại nếu gặp phải một axit khơng phải là axit amin (ví dụ axit isoaspartic), vì chất trung
gian vịng năm cạnh bền khơng thể đƣợc hình thành. Phƣơng pháp thối biến Edman thƣờng khơng hữu ích để xác định vị trí của cầu disulfide. Nĩ cũng cần một lƣợng peptide từ 1 pico-mol trở lên để cĩ kết quả rõ rệt.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu: Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides thu ở vùng biển Ninh Thuận.
Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides
Rong H. eucheumatoides phát triển ở phía Nam miền Trung Việt Nam trong vùng triều ở độ sâu 1,5 - 3 m, nĩ đƣợc thu từ tháng 3 đến tháng 9 và đƣợc sử dụng để nấu kẹo. Trữ lƣợng của rong nhỏ, nhƣng cĩ giá trị cao trên thị trƣờng.
Rong H. eucheumatoides trƣớc đây cĩ tên gọi là Gracilaria eucheumatoides (Harvey). Nguyên nhân là do trƣớc năm 2004, các lồi rong câu ở Việt Nam vẫn đƣợc xếp trong một chi Gracilaria thuộc bộ Gigartinales; nhƣng hiện nay, theo các nghiên cứu mới nhất về hình thái giải phẫu hình thái
cơ quan sinh sản đực và phân tích DNA, các tác giả đã thống nhất sắp xếp chúng vào 3 chi: Gracilaria, Gracilariopsis và Hydropuntia thuộc bộ Gracilariales nên rong Gracilaria eucheumatoides đã đƣợc cập nhật với tên khoa học mới là Hydropuntia eucheumatoides [126, 129].
Rong H. Eucheumatoides đƣợc định danh theo khĩa phân loạ nhƣ sau:
Giới Plantae Ngành Rhodophyta Lớp Florideophyceae Bộ Gracilariales Họ Gracilariaceae Chi Hydropuntia
Lồi Hyropuntia eucheumatoides
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang, Thành phố Nha Trang, Tỉnh Khánh Hịa.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 06/2018 đến tháng 09/2018.
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU, HĨA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nguy n vật iệu
Rong đỏ H. Eucheumatoides đƣợc thu ở biển Ninh Thuận vào tháng 4/2018. Sau khi thu, rong đƣợc rửa sạch bằng nƣớc biển, giữ lạnh và chuyển về phịng thí nghiệm. Rong đƣợc xay nhuyễn trong nitơ lỏng, cho vào các túi nilon và cất giữ lạnh ở - 20 oC cho đến khi dùng.
Hồng cầu của máu thỏ, cừu và gà do Viện Vắc Xin và Sinh Phẩm Y Tế Nha Trang, Tỉnh Khánh Hịa cung cấp. Hồng cầu thuộc các nhĩm máu A, B, O ở ngƣời đƣợc lấy từ Bệnh viện Đa khoa Tỉnh Khánh Hịa.
2.2.2. Hĩa chất
- Các loại đƣờng và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p- nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, laminaran, transferrin,
fetuin, porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan mua từ hãng Merck (Đức).
- Nhựa sắc kí lọc gel Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala – Thụy điển).
- Nhựa sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala – Thụy điển)
- Enzyme trypsine, papain (Sigma – Mỹ). - Thuốc thử Folin (Merck – Đức)
- BSA (Bovine serume albumin – Đức).
- Hĩa chất phân tích các loại: NaH2PO4, Na2HPO4, NaCl, CuSO4, NaOH, Na2CO3, H2SO4, CH3COOH, glyxerol.
Tất cả các hĩa chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt hạng phân tích.
2.2.3. Thiết bị s dụng trong nghi n cứu
Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị Model máy Xuất sứ
1 Máy đo quang phổ UV-Vis 6405UV/VIS Jenway-Anh
2 Máy ly tâm Z36HK Hermel-Đức
3 Máy ly tâm eppendorf 5417R Eppendorf – Đức
4 Máy đo pH 827pH Lab Metrohm-Thụy Sỹ
5 Bể ổn nhiệt B12 Heraeus-Đức
6 Bể siêu âm UTRASONIC Hàn quốc
8 Thiết bị điện di đứng AJ-6530 Atto-Japan
9 Tủ ấm ON-11E Gallenkamp
10 Máy lắc (kiểu trịn) 3017 GFL – Đức
11 Cân phân tích CP224S Satorius – Đức
12 Bộ siêu lọc Toya-Roshi, UHP43 Nhật
13 Máy đo quang Spectro UV 2505/24RS Labomed
14 Cột sắc kí ion 1,6x20 (cm) GE Healthcare –
Thụy điển
15 Các loại Micropipet 2 20 l;20 200 l;... Nichiryo – Nhật
16 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner – Đức
17 Hệ thống bơm và thu phân Frac-920 GE Healthcare –
đoạn Thụy điển
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % (hồng cầu máu thỏ,cừu, gà và các nhĩm máu ngƣời A, B, O) : cừu, gà và các nhĩm máu ngƣời A, B, O) :
Mỗi mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl 0,15 M. Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) đƣợc chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M cĩ chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 và đƣợc dùng nhƣ hồng cầu tự nhiên [13].
Hồng cầu các mẫu máu đƣợc xử lý enzyme tripsin hay papain đƣợc 1
chuẩn bị nhƣ sau: 10 thể tích của dung dịch trypsin hay papain 0,5 % (w/v) đƣợc thêm vào huyền phù các mẫu máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và đƣợc ủ ở 37 oC trong 60 phút. Sau khi ủ, hồng cầu các mẫu máu đƣợc rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hịa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M cĩ
chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2. Ta thu đƣợc huyền phù hồng cầu các mẫu máu 2 % đã xử lý enzyme trypsin hay papain [13].
2.3.2. Phân tích hoạt tính ectin bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà và các nhĩm máu ngƣời A, B, O).
Hoạt tính của lectin đƣợc xác định dựa trên phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu [13].
Các thí nghiệm phân tích hoạt tính của lectin đƣợc thực hiện trong đĩa 96 giếng đáy chữ V. Đầu tiên, cho 25 µL dung dịch đệm photphat 0,02 M cĩ chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V. Tiếp đến cho 25 µL mẫu dịch chiết lectin cần phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha lỗng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ
1
pha lỗng là 2n (n: số lần pha lỗng) và giữ ở nhiệt độ phịng trong khoảng thời gian 1 giờ. Sau đĩ, tiếp tục thêm 25 µL hồng cầu 2 % vào tất cả các giếng, lắc nhẹ nhàng hỗn hợp và giữ ở nhiệt độ phịng trong 2 giờ. Đọc kết quả.
Kết quả dƣơng tính đƣợc thể hiện khi hình thành một lớp chất keo đồng nhất trên bề mặt giếng. Kết quả thử nghiệm là âm tính khi tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ.
Hoạt tính của lectin (HU/mL) đƣợc thể hiện nhƣ là một tiêu chuẩn, và là giá trị nghịch đảo của độ pha lỗng lớn nhất mà dịch chiết lectin cịn cĩ khả năng làm ngƣng kết hồng cầu cho vào phản ứng.
Thí nghiệm đƣợc thực hiện 3 lần đối với mỗi loại hồng cầu đƣợc thử nghiệm.
Hoạt tính lectin: đƣợc xác định theo 2 chỉ số:
-Hoạt tính tổng (Utổng): là tổng số đơn vịhoạt tính cĩ trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU
Utổng = V. 2n Trong đĩ: V: tổng thể tích (mL)
n: số lần pha lỗng
Đơn vị: HU/mg U riêng U tổng Pr oteintổng
Trong đĩ: Utổng: tổng số đơn vị hoạt tính.
Proteintổng: tổng hàm lƣợng protein.
MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất cĩ khả năng gây ngƣng kết hồng cầu đã đƣợc xử lý enzyme. Đơn vị : µg/mL
MAC Hàm lượng protein
HA
2.3.3. Xác định hàm ƣợng protein.
Xác định hàm lƣợng protein bằng phƣơng pháp của Lowry và cộng sự [130], dùng albumin huyết thanh bị (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn.
* Nguyên tắc
Trong mơi trƣờng kiềm, ion Cu2+ tạo thành phức chất với các liên kết peptide trong protein, khi đĩ nĩ bị khử thành ion Cu+. Ion Cu+ và các gốc của Tyrosine, Tryptophan và Cysteine phản ứng với thuốc thử Folin để tạo ra một sản phẩm khơng bền rồi bị khử thành molipden/vonfram xanh. Cƣờng độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định.
Đo cƣờng độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bƣớc sĩng 750nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) cĩ thể xác định đƣợc hàm lƣợng protein ở nồng độ vài chục µg.
* Hĩa chất
-Dung dịch A: 4 gam NaOH (0,1 M) và 20 gam Na2CO3 2 % pha trong 1000 mL nƣớc cất.
- Dung dịch B: 0,5 gam CuSO4.5H2O 0,5 % pha trong dung dịch Natri Xitrat (1 %) hoặc trong dung dịch Natri – Kali Tactrat 1 %.
- Dung dịch C: hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha