CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN
1.3. LECTIN TỪ RONG BIỂN
1.3.1.9. Ứng dụng của lectin từ rong biển
Lectin đƣợc cơ lập từ rong biển rất đa dạng và phong phú. Do cĩ đặc tính là khối lƣợng phân tử nhỏ và sự cĩ mặt của các kiên kết disunlphide, lectin rong biển cĩ tính ổn định cao. Hơn nữa, với cấu trúc nhỏ làm cho chúng trở nên thích hợp hơn khi sử dụng nhƣ các đầu dị chẩn đốn các cấu trúc carbohydrate trên bề mặt tế bào và nhắm đến mục đích dƣợc phẩm [76]. Gần đây, lectin trong rong biển đã nhận đƣợc sự quan tâm đáng kể do cĩ liên kết đặc hiệu với oligosaccharide [87]. Các kết quả nghiên cứu liên quan đến sự phát triển của các cơng cụ để nghiên cứu ung thƣ, HIV và các bệnh khác. Mục tiêu cuối cùng là phát triển các loại thuốc kháng vi khuẩn, ngăn cản virus tấn cơng vào tế bào chủ [109]. Dựa trên đặc điểm liên kết carbohydrate, lectin đã đƣợc sử dụng trong các liệu pháp khác nhau, nhƣ chẩn đốn ung thƣ, dấu hiệu bệnh lý của bệnh, nhận biết glycan và kiểm sốt nhiều loại bệnh.
Các ứng dụng của lectin từ rong biển cĩ thể tĩm tắt theo biểu đồ sau:
Hình 1.5. Biểu đồ thể hiện ứng dụng y sinh của lectin từ rong biển [110].
+ Khả năng kháng đau của lectin:
Tác dụng kháng đau của lectin từ rong biển Amansia multifida,
Bryothamnion seaforthii và Bryothamnion triquetrum đã đƣợc thơng báoở hệ thần kinh trung ƣơng và ngoại vi [111, 112]. Lectin từ Amansia multifida
(Amansin/LEC) cũng đã đƣợc chỉ ra nhƣ thuốc giảm đau tiềm năng [111]. Lectin từ rong Hypnea cervicornis (HCA) cĩ hiệu ứng kháng đau thơng qua sự tƣơng tác giữa carbohydrate và lectin. Lectin từ rong lục Caulerpa cupressoides cho kết quả kháng đau và kháng viêm trong các mơ hình kháng đau và kháng viêm ở chuột [113].
+ Khả năng kháng vi m của lectin:
Lectin HCA cơ lập từ rong Hypnea cervicornis bao gồm khả năng kháng viêm hiệu quả trong kiểu phù nề chân và chứng viêm màng bụng. Kháng viêm hiệu quả cũng thể hiện ở lectin từ các rong Caulerpa cupressoides, Chlorella stigmatophora, Phaeodactylum tricornutum và Amansia multifida [110].
+ Khả năng chống ung thƣ của lectin:
Lectin trong chống ung thƣ cĩ thể dùng nhƣ là đầu dị chẩn đốn. Nhiều lectin trong rong đã đƣợc báo cáo là cĩ khả năng chống khối u, chống lại tế bào ung thƣ ở ngƣời [114]. Chẳng hạn, lecin ESA từ rong Eucheuma serra (ESA) gây chết tế bào ung thƣ đại tràng Colo 201 và tế bào ung thƣ cổ tử cung Hela, cĩ hoạt tính kích thích sự phân bào tế bào lympho của ngƣời và chuột và làm giảm đáng kể khả năng tồn tại của tế bào ung thƣ Colo 201 trong điều kiện thí nghiệm, trong khi các tế bào bình thƣờng vẫn khơng bị ảnh hƣởng [7]. Lectin BSL từ rong Bryothamnion seaforthii và BTL từ rong
Bryothamnion triquetrum cĩ khả năng phân biệt các biến thể tế bào ung thƣ đại tràng ở ngƣời [115]. Ngồi ra lectin từ một số lồi rong khác cũng cĩ khả năng kháng ung thƣ nhƣ: Acrocystis nana [116], Halosaccion glandiforme
[117], Hypnea cervicornis [87], Solieria filiformis [88].
+ Khả năng kháng virus của lectin:
Lectin cĩ nguồn gốc từ rong biển là một nguồn hợp chất kháng virus [118]. Hoạt tính kháng virus phụ thuộc vào khả năng liên kết các oligosacharide chứa manose cĩ trên bề mặt của lớp vỏ virus. Lectin từ vi khuẩn lam và các loại rong biển khác nhau đặc hiệu với dạng giàu mannose, làm cho chúng trở thành ứng cử viên đầy hứa hẹn trong phịng ngừa sự lan truyền khác nhau của màng virus nhƣ: sự suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV), siêu vi khuẩn cúm, siêu vi viêm gan C (HCV), virus Ebola và hội chứng hơ hấp cấp tính nặng (SARS) [103].
Lectin BCA từ rong lục Boodlea coacta cĩ hoạt tính ức chế virus HIV và virus cúm và cho thấy hoạt tính mạnh kháng hầu hết các chủng virus cúm, bao gồm chủng cơ lập của cúm H1N1 [10]. Lectin từ rong Kappaphycus alvarezii (KAA-2) cĩ hoạt tính mạnh kháng hầu hết các chủng virus cúm bao gồm virus cúm H1N1 cĩ nguồn gốc từ lợn [10].
Lectin CV-N đƣợc cơ lập từ vi tảo lục lam Nostoc ellipsosporum cho thấy một loạt các hoạt tính kháng virus cho cúm (A và B), virus Ebola, virus herpes 6 ở ngƣời, HCV và virus sởi [119]. Lectin CV-N cũng là chất ức chế tiềm năng của các chủng HIV-1, HIV-2 và virus suy giảm miễn dịch lâm sàng [120, 121].
Griffithsin (GRFT) – một lectin đƣợc cơ lập từ rong đỏ Griffithsia cũng cho thấy cĩ hoạt tính chống HIV mạnh, với nồng độ hiệu quả (EC50) là 0,043 – 0,63 µM [75].
1.3.2. Tình hình nghi n cứu ectin từ rong biển trong nƣớc
Ở Việt Nam, các nghiên cứu về lectin trong rong chủ yếu là các nghiên cứu của TS Lê Đình Hùng và cộng sự tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang, bao gồm các kết quả sàng lọc lectin từ 88 mẫu rong biển [13, 16], tinh chế và mơ tả đặc tính của lectin từ rong đỏ Kappaphycus alvarezii,
Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum, Gracilaria salicornia,
Hydropuntia eucheumatoides và từbọt biển Stylissa flexibilis [14, 15, 17, 122, 123, 124], các dịng cDNA mã hĩa lectin từ rong K. striatum và E. denticulatum [17, 18, 107] và sự thay đổi theo mùa trong hàm lƣợng lectin từ các rong đỏ đang nuơi trồng K. alvarezii và K. striatus [125].
Những nghiên cứu về đặc tính lectin cho thấy rằng: lectin từ rong biển khác với lectin từ thực vật bậc cao ở một số tính chất: nhiều lectin từ rong biển thƣờng tồn tại dạng monomer và cĩ khối lƣợng phân tử nhỏ hơn lectin từ thực vật bậc cao, hoạt tính ngƣng kết của chúng bền trong một khoảng rộng của nhiệt độ và pH, khơng phụ thuộc vào cation hĩa trị 2. Lectin từ rong biển hầu hết khơng cĩ ái lực với đƣờng đơn nhƣng cĩ đặc tính liên kết carbohydrate với các glycoprotein (liên kết dạng O-glycan hay N-glycan) [98]. Chính vì vậy khả năng ứng dụng lectin từ rong biển trong y học ngày càng đƣợc chú ý.
Dựa trên kết quả sàng lọc hemagglutinin từ rong biển Việt Nam [13] cho thấy rằng: đặc tính liên kết carbohydrate của chi rong Gracilaria cĩ nhiều điểm khác so với các chi rong khác, chúng đặc hiệu với các glycoprotein dạng
dạng O-glycan. Rong đỏ H. eucheumatoides trƣớc đây là lồi rong thuộc chi Gracilaria, từ năm 2004 chi Gracilaria đƣợc đổi tên thành chi Hydropuntia [126]. Rong H. eucheumatoides dùng để sản xuất agar ở Việt Nam và thế giới. Trên thế giới, rong phân bố nhiều trên quần đảo Palau (Tây Thái Bình Dƣơng), quần đảo Montebello (Tây Úc),...; ở nƣớc ta rong cĩ trữ lƣợng lớn ở vùng biển Nha Trang và Ninh Thuận. Đây chính là những điều kiện thuận lợi giúp chúng tơi nghiên cứu, phân tích những đặc tính của lectin từ lồi rong này, từ đĩ cĩ những định hƣớng để sử dụng lectin từ rong H. eucheumatoides
trong tƣơng lai.
1.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN
1.4.1. Sắc ký trao đổi ion
Lectin cĩ bản chất protein nên phân tử của nĩ mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của mơi trƣờng mà lectin mang điện tích dƣơng hoặc âm. Lợi dụng tính chất này ngƣời ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhĩm chứa ion tích điện dƣơng nhƣ DEAE- sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhĩm chức ion tích điện âm nhƣ CM- sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…đƣợc sử dụng làm chất trao đổi cation. Mỗi chất trao đổi ion đều cĩ khả năng trao đổi một lƣợng ion nhất định gọi là dung lƣợng trao đổi. Ngƣời ta cĩ thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hĩa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện mơi trƣờng pH nhất định.
1.4.2. Sắc ký ọc ge
Đây là phƣơng pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thƣớc phân tử. Chất nhựa thƣờng đƣợc sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex cĩ bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lƣới xốp. Cĩ nhiều loại Sephadex, trong đĩ mỗi loại cĩ mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thƣớc của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất cĩ kích thƣớc phân tử
khác nhau. Để tinh chế lectin, ngƣời ta thƣờng dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100.
Phƣơng pháp sắc ký lọc gel cịn đƣợc dùng để xác định khối lƣợng phân tử của chất cần tách.
1.4.3. Sắc ký ái ực
Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) đƣợc gắn vào một chất nền tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất nhựa đƣợc sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực đƣợc tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.
+ Giai đoạn 1: Thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp cĩ ái lực đặc hiệu với lectin cần tách cĩ ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần phải dựa vào tính chất của lectin cần tách, đặc tính lý hĩa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa lectin và chất kết hợp. Trong các thí nghiệm tinh chế lectin ngƣời ta thƣờng lựa chọn các chất đƣờng, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đƣờng cĩ ái lực hĩa học với một lectin nhất định.
+ Giai đoạn 2: Hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất khơng cĩ ái lực với cột: Các lectin cĩ ái lực với cột cần đƣợc tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein khơng cĩ ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột.
+Giai đoạn 3: Giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: Cần phải dùng một dung dịch giải hấp phụ cĩ ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dịng chảy.
1.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEINDỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG
Phƣơng pháp khối phổ hay phƣơng pháp phổ khối lƣợng (Mass spectrometry – MS) là một kỹ thuật dùng để xác định tỉ lệ khối lƣợng/điện tích (m/z). Phƣơng pháp phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, ví dụ trong hĩa học phƣơng pháp này cĩ nhiều ứng dụng quan trọng nhƣ: xác định phân tử khối khối phổ, nhận biết các chất cùng với cơng thức cấu trúc của chúng, xác định cơng thức cấu trúc của phân tử. Phƣơng pháp này cĩ khả năng phát hiện ra các hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10-12 đến 10-6 gam.
1.5.1. Nguy n tắc chung
Khi cho các phân tử ở trạng thái khí va chạm với một dịng electron cĩ năng lƣợng cao thì từ các phân tử sẽ bật ra 1 hay 2 electron, khi đĩ nĩ trở thành các ion mang điện tích : +1, +2 (trong đĩ ion cĩ điện tích +1 chiếm tỉ lệ lớn).
ABC + e ABC+ + 2e (1) ABC+2 + 3e (2) Ion (1) đƣợc gọi là ion gốc hay ion phân tử.
Nếu các ion phân tử tiếp tục va chạm với dịng electron cĩ năng lƣợng cao thì chúng sẽ bị phá vỡ thành nhiều mảnh ion, tạo nên các gốc hoặc các phân tử trung hịa khác nhau. Quá trình này đƣợc gọi là quá trình phân mảnh (fragmentation).
ABC+ A+ + BC ABC+ AB+ + C
A++B
Năng lƣợng của quá trình phân mảnh chỉ vào khoảng 30 – 100 eV, cao hơn năng lƣợng ion hĩa phân tử (8 – 15 eV).
Các ion cĩ khối lƣợng m và điện tích e. Tỉ số m/e đƣợc gọi là số khối z. Bằng cách nào đĩ tách các ion cĩ số khối khác nhau ra khỏi nhau và xác định đƣợc xác suất cĩ mặt của chúng. Tiến hành vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa xác suất cĩ mặt (hay cƣờng độ I) và số khối z, đồ thị thu đƣợc chính là phổ khối lƣợng [127]
Từ vị trí của các peak phân tử đọc đƣợc trên phổ khối lƣợng ta sẽ biết đƣợc số khối của phân tử hay cịn gọi là phân tử khối khối phổ.
1.5.2. Phƣơng pháp xác định phân t khối của protein
Lectin cĩ bản chất là protein hoặc glycoprotein, chúng là các polyme đƣợc tạo thành từ sự kết hợp của 20 loại α-amino axit thơng qua các liên kết peptide. Dƣới tác dụng của các tác nhân, lectin sẽ bị phân cắt thành các chuỗi peptide ngắn hơn. Ví dụ: xian bromua (BrCN) cĩ khả năng phân cắt mạch peptit sau gốc Methionin (Met); hoặc enzyme Tripsin cĩ khả năng phân cắt liên kết sau gốc Lysin (Lys) và Arginin (Arg), emzyme Chimotripsin cĩ khả năng phân cắt liên kết sau gốc Phenylalanin (Phe), Tyrosin (Tyr), Leuxin (Leu), Axit aspactic (Asp), Axit glutamic (Glu) và Trytophan (Trp),.... Sau khi các chuỗi peptide đƣợc tinh chế, tiến hành cho mẫu vào máy phân tích khối phổ, thu khối phổ đồ. Từ đĩ xác định phân tử khối của protein.
1.6. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONGLECTIN LECTIN
Trình tự các axit amin trong protein nĩi chung cũng nhƣ lectin nĩi riêng đƣợc xác định theo phƣơng pháp thối biến Edman [128], phƣơng pháp này đƣợc phát triển bởi Pehr Edman, đây là một phƣơng pháp xác định trình tự các axit amin trong chuỗi peptide. Trong phƣơng pháp này, gốc axit amin đầu cuối (đầu N) đƣợc đánh dấu và tách khỏi peptide mà khơng làm phá vỡ liên kết peptide giữa các gốc axit amin khác.
Cơ chế của phản ứng:
Phenyl isothiocyanate phản ứng với nhĩm –NH2 của axit amin đầu N khơng mang điện tích, trong mơi trƣờng kiềm nhẹ tạo thành dẫn xuất phenylthiocarbamoyl. Tiếp đến, trong mơi trƣờng axit, dẫn xuất này bị phân cắt thành dẫn xuất thiazolinone. Sau đĩ, axit amin thiazolinone đƣợc chiết với dung mơi hữu cơ thích hợp và đƣợc xử lý bằng axit để tạo thành phenylthiohydantoin (PTH) ổn định hơn – dẫn xuất axit amin cĩ thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký hoặc điện di. Quá trình này đƣợc lặp lại một lần nữa để xác định axit amin tiếp theo. Chiều dài chuỗi peptide bị hạn chế do quá trình tạo dẫn xuất khơng phải lúc nào cũng hình thành hồn chỉnh. Vấn đề tạo dẫn xuất cĩ thể đƣợc giải quyết bằng cách tách các peptide lớn thành các peptide nhỏ hơn trƣớc khi tiến hành phản ứng. Phƣơng pháp này cĩ khả năng sắp xếp chính xác đến 30 axit amin. Ƣu điểm lớn của phƣơng pháp suy thối Edman là phản ứng chỉ cần sử dụng 10 – 100 pico-mol peptide cho quá trình xác định trình tự chuỗi peptide.
Hạn chế của phương pháp suy thối Edman:
Vì sự thối biến Edman bắt nguồn từ đầu N của protein nên nĩ sẽ khơng hoạt động nếu đầu N đã bị biến đổi hĩa học (ví dụ nhĩm –NH2 bị acetyl hĩa hoặc hình thành axit pyroglutamic). Trình tự sẽ dừng lại nếu gặp phải một axit khơng phải là axit amin (ví dụ axit isoaspartic), vì chất trung
gian vịng năm cạnh bền khơng thể đƣợc hình thành. Phƣơng pháp thối biến Edman thƣờng khơng hữu ích để xác định vị trí của cầu disulfide. Nĩ cũng cần một lƣợng peptide từ 1 pico-mol trở lên để cĩ kết quả rõ rệt.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu: Rong đỏ Hydropuntia eucheumatoides thu ở vùng biển Ninh Thuận.
Hình 2.1. Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides
Rong H. eucheumatoides phát triển ở phía Nam miền Trung Việt Nam trong vùng triều ở độ sâu 1,5 - 3 m, nĩ đƣợc thu từ tháng 3 đến tháng 9 và đƣợc sử dụng để nấu kẹo. Trữ lƣợng của rong nhỏ, nhƣng cĩ giá trị cao trên thị trƣờng.
Rong H. eucheumatoides trƣớc đây cĩ tên gọi là Gracilaria eucheumatoides (Harvey). Nguyên nhân là do trƣớc năm 2004, các lồi rong câu ở Việt Nam vẫn đƣợc xếp trong một chi Gracilaria thuộc bộ Gigartinales; nhƣng hiện nay, theo các nghiên cứu mới nhất về hình thái giải phẫu hình thái
cơ quan sinh sản đực và phân tích DNA, các tác giả đã thống nhất sắp xếp chúng vào 3 chi: Gracilaria, Gracilariopsis và Hydropuntia thuộc bộ Gracilariales nên rong Gracilaria eucheumatoides đã đƣợc cập nhật với tên khoa học mới là Hydropuntia eucheumatoides [126, 129].
Rong H. Eucheumatoides đƣợc định danh theo khĩa phân loạ nhƣ sau:
Giới Plantae Ngành Rhodophyta