a: 19 °C b: 21 °C
c: 23 °C d: 25 °C.
Kết quả thể hiện trong bảng 3.9 đã thể hiện rõ số vi củ, đƣờng kính vi củ và khối lƣợng tƣơi vi củ của mẫu phôi soma in vitro. Ở điều kiện nhiệt độ 19 °C cho số vi củ cao nhất 1,93 vi củ/mẫu, sau đó là ở nhiệt độ 21 °C 1,53 vi củ/mẫu, tiếp theo điều kiện nhiệt độ 23 °C cho số vi củ 1,13 vi củ/mẫu và cho số vi củ thấp nhất ( 0,73 vi củ/mẫu) là ở nhiệt độ 25 °C, giữa các nghiệm thức này có sự khác biệt về mặt thống kê.
Mặt khác, đƣờng kính vi củ ở điều kiện nhiệt độ 19 °C cho giá trị cao nhất 0,34 cm, không có sự khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức ở nhiệt độ 21 °C (0,32 cm) và có sự khác biệt không quá rõ ràng so với nghiệm
a
d b
thức ở nhiệt độ 23 °C (0,27 cm). Ở điều kiện nhiệt độ 25 °C cho đƣờng kính vi củ nhỏ nhất 0,22 cm, có sự khác biệt về mặt thống kê so với 2 nghiệm thức ở điều kiện nhiệt độ 19 °C và 21 °C. Tƣơng tự, khối lƣợng tƣơi vi củ ở điều kiện nhiệt độ 19 °C cho khối lƣợng tƣơi cao nhất với giá trị 0,05 g, không có sự khác biệt so với nghiệm thức ở nhiệt độ 21 °C (0,04 g) nhƣng có sự khác biệt về mặt thống kê so với 2 nghiệm thức ở nhiệt độ 23 °C và 25 °C. Nghiệm thức có khối lƣợng tƣơi vi củ thấp nhất (0,02 g) là nghiệm thức ở điều kiện nhiệt độ 25 °C, không có sự khác biệt về mặt thống kê so với nghiệm thức 21 °C (0,03 g).
Nhiệt độ ảnh hƣởng đến các quá trình sinh lý khác nhau, chẳng hạn nhƣ hô hấp và quang hợp, ngoài ra nó còn ảnh hƣởng sâu sắc đến nuôi cấy mô thực vật và vi nhân giống. Nhiệt độ nuôi cấy phổ biến nhất khoảng từ 20 °C đến 27 °C, nhƣng nhiệt độ tối ƣu rất khác nhau, tùy thuộc vào kiểu gen [81];[91]. Theo kết quả trên, nhiệt độ ảnh hƣởng nhiều đến sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh. Tƣơng tự kết quả nghiên cứu của Lin và cộng sự (2020) cho thấy điều kiện nuôi cấy tối ƣu trong giai đoạn tăng sinh protocorm D. cariniferum là 23 ± 2 °C [92]. Bên cạnh đó, nhiệt độ càng cao thì quá trình hình thành vi củ càng giảm rõ rệt. Sự khác biệt này có thể là do khi thực vật tiếp xúc với nhiệt độ đều bị tổn thƣơng, biểu hiện giảm hoặc ngừng tăng trƣởng [93] và mức độ tổn thƣơng có thể thay đổi theo loài thực vật, giai đoạn phát triển của cây trồng và với các điều kiện xử lý nhƣ chiếu xạ và khoáng chất, dinh dƣỡng [94]. Nhƣ nghiên cứu của Tang và cộng sự (2020) cho thấy nhiệt độ tối ƣu để nhân giống L. davidii var. unicolor là 30 °C [95].
Qua kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm trên thì ở 2 nghiệm thức nhiệt độ 19 °C và 21 °C cho số vi củ cao nhất nên tiến hành chạy bài toán tối ƣu ở 2 nghiệm thức này.
3.2.4 Bài toán tối ƣu
Bảng 3.10: Bố trí ma trận các thí nghiệm thực nghiệm
TT
Biến mã hoá Biến thực
Y1:Số vi củ (Vi củ/mẫu X1 X2 X3 Z1 Nhiệt độ (oC) Z2: Điều kiện thoáng khí Z3:Ánh sáng (µmol m-2s-1) 1 1 -1 0 21 A 53,6 1 2 1 1 0 21 B 53,6 1,4 3 -1 1 0 19 B 53,6 2,4 4 1 -1 0 21 A 53,6 1,2 5 1 1 0 21 B 53,6 1,4 6 1 1 0 21 B 53,6 1,4 7 -1 1 0 19 B 53,6 2,4 8 -1 -1 0 19 A 53,6 2 9 -1 -1 0 19 A 53,6 2 10 1 -1 0 21 A 53,6 1 11 -1 1 0 19 B 53,6 2,2 12 -1 -1 0 19 A 53,6 2 13 0 -1 0 20 A 53,6 1,4 14 0 -1 0 20 A 53,6 1,4 15 0 -1 0 20 A 53,6 1,6
Phƣơng trình hồi quy nhận đƣợc nhƣ sau:
Y1= 1,68889 - 0,466667x1 + 0,177778x2
Kết quả phân tích ANOVA cho thấy, mô hình có ý nghĩa thống kê (P<0,001), hệ số hồi quy R2 là 0,972 > 0,75 chứng tỏ mô hình tƣơng thích với thực nghiệm. Hơn nữa, giá trị R2 dự đoán là 0,962 phù hợp với R2 điều chỉnh.
Kết quả phân tích phƣơng sai (ANOVA) cho thấy ảnh hƣởng của các nhân tố đến hàm mục tiêu. Mô hình cho thấy yếu tố nhiệt độ, điều kiện thoáng khí có ảnh hƣởng lên khả năng tạo ra vi củ. Yếu tố ánh sáng cũng có ảnh hƣởng đến sự phát sinh vi củ nhƣng vì là hằng số nên mức độ ảnh hƣởng của nó đến hàm mục tiêu luôn luôn bằng một hằng số với bậc tự do bằng 1.
Bảng 3.11: Bảng mức độ ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh Yếu tố ảnh hƣởng Đơn vị Kí hiệu Mức độ ảnh hƣởng Giá trị P Nhiệt độ oC x1 - 0,93333 2,9-10 Điều kiện thoáng khí x2 0,355556 4,6-6 Ánh sáng µmol m-2s-1 x3 Df = 1
Theo kết quả phân tích thì ở nhiệt độ 19 oC, điều kiện thoáng khí chai nút bông và sử dụng ánh sáng LED với cƣờng độ 53,6 µmol m-2s-1 cho kết quả cực trị là 2,46 vi củ/mẫu.
Tiến hành thử nghiệm lại nghiệm thức cực trị cho kết quả trung bình nhận đƣợc là 2,33 vi củ/mẫu rất gần so với kết quả phân tích.
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN
Từ các kết quả đã thu nhận đƣợc, đề tài đã rút ra đƣợc một số kết luận nhƣ sau:
Khảo sát đƣợc ảnh hƣởng của hoá chất trong giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh. Số vi củ hình thành cao nhất là 1,80 (vi củ/mẫu) ở môi trƣờng có bổ sung 1 g/l casein hydrolysate so với môi trƣờng có bổ sung myo- inositol, L-tyrosine, adenine sulphate, pepton và cao nấm men. Vậy môi trƣờng thích hợp cho quá trình hình thành vi củ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro là môi trƣờng SH có bổ sung 1,0 mg/l BA và 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l và 1,0 g/l casein hydrolysate.
Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh cho khả năng hình thành vi củ cao nhất 2,13 (vi củ/mẫu) khi nuôi cấy dƣới ánh sáng đèn LED so với mẫu phôi soma nuôi cấy dƣới đèn huỳnh quang.
Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh khi nuôi cấy trong chai dùng nút bông cho khả năng hình thành vi củ cao nhất 1,67 (vi củ/mẫu) so với mẫu phôi soma khi nuôi cấy trong chai dùng màn lọc khí, bịch có màn lọc khí và bịch không có màn lọc khí.
Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 19 °C cho khả năng hình thành vi củ cao nhất 1,93 (vi củ/mẫu) so với mẫu phôi soma khi nuôi cấy ở nhiệt độ 21 °C, 23 °C và 25 °C.
Từ các yếu tố vật lý ban đầu (nuôi cấy dƣới ánh sáng đèn LED, nuôi cấy trong chai dùng nút bông và chai dùng màn lọc khí, nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 19 °C và 21 °C), sử dụng phần mềm MODDE 5 tối ƣu hóa điều kiện vật lý cho quá trình hình thành vi củ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh cao nhất với nhiệt độ ở 19 °C, dƣới ánh sáng đèn LED và chúng đƣợc nuôi cấy trong chai nƣớc biển dùng nút bông.
4.2 KIẾN NGHỊ
Tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của các loại đèn LED lên quá trình hình thành vi củ từ phôi soma sâm Ngọc Linh.
Tiếp tục tiến hành thí nghiêm khảo sát môi trƣờng và điều kiện vật lý thích hợp cho quá trình hình thành rễ của vi củ sâm Ngọc Linh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyen Minh Duc, 1994, Chemical Study on the Saponin Composition of Vietnamese Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv. - Araliaceae), Doctoral Thesis, Hiroshima University School of Medicine, Japan.
2. Nguyễn Thƣợng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hƣơng, 2007, Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân sâm, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
3. http://baochinhphu.vn/Utilities/PrintView.aspx?distributionid=397375 4. Nguyễn Văn Đạt, Trần Thị Phƣơng Anh, Vũ Tiến Chính, Phan Kế Long, Hoàng Lê Tuấn Anh, 2017, Chi sâm – Panax L. (Họ ngũ gia bì - araliaceae), Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, tr. 106 - 112.
5. Nguyễn Minh Đức, Lê Thị Hồng Vân, 2019, Báo cáo phân tích xu hƣớng công nghệ: xu hƣớng công nghệ trồng sâm phi lâm nghiệp, Sở khoa học và công nghệ Tp.HCM, trung tâm thông tin và thống kê khoa học và công nghệ.
6. Nguyễn Minh Đức, Lê Thị Hồng Vân, 2019, Tổng quan về tình hình phát triểnvà thị trƣờng sâm.
7. https://vi.wikipedia.org/wiki/Chi_S%C3%A2m
8. https://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh 9. http://tracuuduoclieu.vn/sam-ngoc-linh.html
10. Đỗ Huy Bích, 2006, Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở việt nam (tập 2) – phần 1, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tr. 704 - 713.
11. Đỗ Tất Lợi, 1999, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr. 808 - 810.
12. Luan T.C., De P.V., Bich L.K., Nguyen N.T., Huan V.D., Huong N.T.T., Phu D.T., 2001, Screening for medicinal plants of Araliaceae family which have effects of strengthening and antistress, Proceeding Pharma Indochina II, SRV Ministry of Health and Hanoi College of Pharmacy, Vietnam, pp. 329 - 334.
components, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 21, pp. 978 - 981.
14. Ngô Văn Thu, 2004, Bài giảng dược liệu tập 1, Bộ môn dƣợc liệu trƣờng đại học Y Dƣợc TP. Hồ Chí Minh và trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội.
15. Deng J., Zhou Y., Bai M., Li H., Li L., 2010, Anxiolytic and sedative activities of Passiflora edulis f. flavicarpa, Journal of Ethnopharmacology, 128(1), pp. 148 - 153.
16. Duc N.M., Nham N.T., Kasai R., Ito A., Yamasaki K., Tanaka O., 1993, Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. collected in central Vietnam. I, Chemical and pharmaceutical bulletin, 41(11), pp. 2010 - 2014.
17. Vũ Thị Hiền, 2018, Nghiên cứu quá trình tái sinh và nhân giống in vitro cây sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào, Luận án tiến sĩ sinh học.
18. Dƣơng Tấn Nhựt, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Trực, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Tình, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hƣơng, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Lê Nữ Minh Thùy, Lý Thị Mỹ Nga, Thái Thƣơng Hiền, Nguyễn Thành Hải, 2010, Nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3B), tr. 1211-1219.
19. Hoàng Xuân Chiến, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Trực, Trần Xuân Tình, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận, Dƣơng Tấn Nhựt, 2011, Nghiên cứu một số yếu tố tạo củ sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro
và xác định hàm lƣợng saponin trong cây tạo từ củ trồng thử nghiệm trên núi Ngọc Linh, Tạp chí Công Nghệ Sinh học, 9(3), tr. 317 - 331.
20. Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Nam, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Dƣơng Tấn Nhựt, 2013, Nghiên cứu tác động của ánh sáng đèn LED lên khả năng tăng sinh mô sẹo và sự hình thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Kỷ yếu Hội nghị CNSH toàn quốc, Hà Nội, tr. 1038 - 1042.
21. Duong Tan Nhut, Nguyen Phuc Huy, Ngo Thanh Tai, Nguyen Ba Nam, Vu Quoc Luan, Vu Thi Hien, Hoang Thanh Tung, Bui The Vinh, Tran Cong
Luan, 2015, Light - emitting Diodes and Their Potential in Callus Growth, Plantlet Development and Saponin Accumulation During Somatic Embryogenesis of Panax vietnamensis Ha et Grushv., Biotechnology & Biotechnological Equipment, 29(2), pp. 299 - 308.
22. K. Claire, Le Gal N., Monteiro M., Dommes J., Gaspar T., 2000, Somatic embryogenesis of panax ginseng in liquid cultures: a role for polyamines and their metabolic pathways, Plant Growth Regulation, 31(3), pp. 209 - 214.
23. Palazón J., Mallol A., Eibl R., Lettenbauer C., Cusidó R.M., Piñol M.T., 2003, Growth and ginsenoside production in hairy root cultures of Panax ginseng using a novel bioreactor, Planta medica, 69(04), pp. 344 - 349.
24. Wu J.Y., Wong K., Ho K., Zhou L., 2005, Enhancement of saponin production in Panax giseng cell cutures by osmotic stress and nutrient feeding, Enzyme and Microbial Technology, 36, pp. 133 - 138.
25. Marsik P., Langhansova L., Dvorakova M., Digler P., Hruby M., Vanek T., 2014, Increased ginsenosides production by elicitation of in vitro
cultivated Panax ginseng adventitious roots, Med Aromat Plants, 3, pp. 1 - 5. 26. Vasyutkina E.A., Adrianova I.Y., Reunova G.D., Nguyen T.P.T., Zhuravlev Y.N., 2018, A Comparative Analysis of Genetic Variability and Differentiation in Panax vietnamensis Ha et Grushv., P. ginseng CA Meyer Using ISSR Markers, Russian Journal of Genetics, 54(2), pp. 262 - 265.
27. Majerowicz N., Peres L.E.P., 2008, Fotomorfogenese em plantas. In: Kerbauy G.B. (ed), Fisiologia vegetal, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 28. Faravani M., Bakar B.B., 2007, Effects of light on seed germination, growth pattern of traits Rhododendron (Melastoma malabathricum L.), Journal of Agricultural and Biological Science, 2(3), pp. 1 - 5.
29. Lee S.H., Tewari R.K., Hahn E.J., Paek K.Y., 2007, Photon flux and light quality induce changes in growth, stomatal development, photosynthesis and transpiration of Withania somnifera (L.) Dunal, Plantlets, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 90(2), pp. 141 -151.
30. Montagnoli G., 2008, Biological effects of light on proteins: Enzyme activity modulation, Photochemistry and Photobiology, 26(6), pp. 679 - 683.
31. Ma L., Li J., Qu J., Hager J., Chen Z., Zhao H., Deng X.W., 2001, Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways, Plant Cell, 13(12), pp. 2589 - 2607.
32. Rout G.R., Samantaray S., Das P., 1995, Somatic embryogen-esis and plant regeneration from callus culture of Acacia catechu: a multipurpose leguminous tree, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 42(3), pp. 283 - 285. 33. Zhong J.J., Yoshida T., 1993, Effects of temperature on cell growth and anthocyanin production by suspension cul-tures of Perilla frutescenscells,
Journal of fermentation and bioengineering, 76(6), pp. 530 - 531.
34. Verbruggen N., Hermans C., 2008, Proline accumulation in plants: a review, Amino Acids, 35(4), pp. 753 - 759.
35. Pawar B., Prashant K., Bahurupe J., Jadhav A., Anil K., Pawar S., 2015, Proline and glutamine improve in vitro callus induction and subsequent shooting in rice, Rice Science, 22(6), pp. 283 - 289.
36. Đỗ Đăng Giáp, Phạm Ngọc Vinh, Trần Trọng Tuấn, Nguyễn Thị Huyền Trang, Phạm Ngô Ánh Thƣ, Thái Xuân Du, 2012, Tăng hệ số nhân nhanh chồi chuối Laba (musa sp.) nuôi cấy in vitro bằng cách sử dụng ánh sáng, myo-inositol và adenin sulphate, Tạp chí sinh học, 34(3), tr. 180 - 187. 37. Saha M., Phatak A., Chandra N., 2004, In vitro culture studies in four dioecious varieties of Carica papaya L. using axillary buds from field-grown plants, Journal of Tissue Research, 4(2), pp. 211 - 214.
38. Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Thị Kim Loan, Trần Trọng Tuấn, Lê Thanh Tuấn, Huỳnh Lê Thiên Tứ, Thái Xuân Du, Nguyễn Đình Lâm, Dƣơng Tấn Nhựt, 2013, Ảnh hƣởng của một số acid amine và spemindin lên sự hình thành phôi vô tính cây cọc rào (jatropha curcas L.), Tạp chí sinh học, 35(3), tr 136 - 144.
39. Cote G.G., Crain R.C., 1993, Biochemistry of phosphoinositides,
Annual Review of Plant Physiology, 44(1), pp. 333 - 356.
40. Loewus F., 1990, Structure and occurrence of inositols in plants,
Inositol Metabolism in Plants, pp. 1 - 11.
environmental stresses, The Plant Cell, 7(7), pp. 1099 - 1111.
42. Bandurski R.S., 1979, Chemistry and physiology of myo-inositol esters of indole 3-acetic acid, Cyclitols and phosphoinositides, Academic Press, pp. 35 - 54.
43. Kowalczyk S., Bandurski R., 1991, Enzymatic synthesis of 1-O-(indol- 3-ylacetyl)-beta-D-glucose: purification of the enzyme from Zea mays, and preparation of antibodies to the enzyme, Biochemistry Journal, 279(2), pp. 509 - 514.
44. Lee S.W., 2003, Micropropagation of Cavendish banana in Taiwan,
Taiwan Banana Research Institute.
45. Kaul K., Sabharwal P.S., 1975, Effect of inositol on growth and differentiation, American Journal of Botany, 62, pp. 655 – 659.
46. Ertola R.J., Hours R., 1998, Role of yeast extract components in microbial cultures not associated with amino acid, vitamins and minerals a review, Applied Biological Sciences, 4, pp. 1 - 15.
47. Georg E.F., Hall M.A., De Klerk G.J., 2008, Plant propagation by tissue culture, Volume 1, Dordrecht: The Background, Springer.
48. George E.F., Hall M.A., De Klerk G.J., 2008, The components of plant tissue culture media II: organic additions, osmotic and pH effects, and support systems, In Plant propagation by tissue culture, Springer, Dordrecht, pp. 115 -