CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4 PHƢƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của hóa chất nuôi cấy trong giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma trong giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma
2.4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của myo-inositol lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định nồng độ của myo-inositol tối ƣu giúp phôi soma hình thành vi củ tốt nhất.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng SH (bổ sung 1,0 mg/l BA và 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l [19]) đồng thời bổ sung thêm myo-inositol ở các nồng độ khác nhau (0 g/l; 0,5 g/l; 1 g/l; 1,5 g/l và 2 g/l). Ghi nhận ảnh hƣởng của myo-inositol ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của adenine sulphate lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định nồng độ của adenine sulphate tối ƣu giúp phôi soma hình thành vi củ tốt nhất.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng SH (bổ sung 1,0 mg/l BA và 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l [19]) và bổ sung thêm adenine sulphate với các nồng độ khác nhau (0 g/l; 0,5 g/l; 1 g/l; 1,5 g/l và 2 g/l). Ghi nhận ảnh hƣởng của adenine sulphate ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của L-tyrosine lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định nồng độ của L-tyrosine tối ƣu giúp phôi soma hình thành vi củ tốt nhất.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng SH (bổ sung 1,0 mg/l BA và 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l [19]) và bổ sung thêm L-tyrosine với các nồng độ khác nhau (0 g/l; 0,5 g/l; 1 g/l; 1,5 g/l và 2 g/l). Ghi nhận ảnh hƣởng của L-tyrosine ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của casein hydrolysate lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định nồng độ của casein hydrolysate tối ƣu giúp phôi soma hình thành vi củ tốt nhất.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng SH (bổ sung 2,0 mg/l BA và 1,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l [19]) và bổ sung thêm casein hydrolysate với các nồng độ khác nhau (0 g/l; 0,5 g/l; 1 g/l; 1,5 g/l và 2 g/l). Ghi nhận ảnh hƣởng của casein hydrolysate ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.1.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của peptone lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
thành vi củ tốt nhất.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng SH (bổ sung 1,0 mg/l BA và 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l [19]) và bổ sung thêm peptone với các nồng độ khác nhau (0 g/l; 0,5 g/l; 1 g/l; 1,5 g/l và 2 g/l). Ghi nhận ảnh hƣởng của peptone ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.1.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của cao nấm men lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định nồng độ của cao nấm men tối ƣu giúp phôi soma hình thành vi củ tốt nhất.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng SH (bổ sung 1,0 mg/l BA và 2,0 mg/l NAA, sucrose 50 g/l [19]) và bổ sung thêm cao nấm men với các nồng độ khác nhau (0 g/l; 0,5 g/l; 1 g/l; 1,5 g/l và 2 g/l). Ghi nhận ảnh hƣởng của nấm men ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và mỗi thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
Từ kết quả của các thí nghiệm 1- 6, chọn ra môi trƣờng tốt nhất, khảo sát ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh.
2.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hƣởng của điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn hình thành vi củ sâm Ngọc Linh từ nuôi cấy phôi soma
2.4.2.1 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định điều kiện chiếu sáng tốt nhất lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng tối ƣu của nội dung 1 và đặt dƣới các điều kiện chiếu sáng khác nhau (đèn huỳnh quang cƣờng độ 24,5 µmol m-2s-1 và đèn LED có nhiều màu kết hợp cƣờng độ 53,6 µmol m-2
s-1). Ghi nhận ảnh hƣởng của ánh sáng ở các điều kiện khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.2.2 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện thoáng khí lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định điều kiện thoáng khí tốt nhất lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng tối ƣu của nội dung 1 và đặt dƣới các điều kiện thoáng khí khác nhau (bịch chịu nhiệt thoáng khí có màn lọc khí, bịch chịu nhiệt không thoáng khí không có màn lọc khí, chai thủy tinh với nút bông và chai thủy tinh với màn lọc khí). Ghi nhận ảnh hƣởng ở các điều kiện khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.2.3 Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Mục đích: xác định điều kiện nhiệt độ tốt nhất lên khả hình thành vi củ sâm Ngọc Linh.
Cách tiến hành: Mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh in vitro tƣơng đối đồng nhất có chiều cao khoảng 0,5 cm (sau 30 ngày nuôi cấy) cấy sang môi trƣờng tối ƣu của nội dung 1 và đặt dƣới các điều kiện nhiệt khác nhau (19 ºC; 21 ºC; 23 ºC và 25 ºC). Ghi nhận sự ảnh hƣởng ở các nhiệt độ khác nhau lên sự hình thành vi củ sau tám tuần nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức cấy 5 mẫu và thí nghiệm đƣợc thực hiện với 3 lần lặp lại.
Chỉ tiêu theo dõi: số lƣợng vi củ hình thành (vi củ/mẫu), khối lƣợng tƣơi của vi củ (g), đƣờng kính vi củ (cm).
2.4.2.4 Bài toán tối ưu
Mục đích: xác định đƣợc điều kiện tối ƣu nhất cho quá trình hình thành vi củ từ phôi soma sâm Ngọc Linh qua phƣơng trình tối tối ƣu.
Cách tiến hành:
Tối ƣu điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm: Nhiệt độ (x1), điều kiện thoáng khí (x2) và ánh sáng (x3).
Tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp leo dốc ứng với ba yếu tố ảnh hƣởng đƣợc khảo sát: Nhiệt độ (x1), điều kiện thoáng khí (x2) và ánh sáng (x3).
Hàm mục tiêu (y1) là số vi củ (vi củ/mẫu) của hình thành. Phƣơng trình hồi quy có dạng:
y1=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b13x1x3+b23x2x3+b123x1x2x3 Với : b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23 - các hệ số của phƣơng trình hồi quy.
Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm và xác định các hệ số của phƣơng trình hồi quy với mục tiêu khảo sát ba yếu tố ảnh hƣởng, số thí nghiệm cần phải tiến hành N = 24 = 16.
Bảng 2.1: Các mức và khoảng biến thiên của thí nghiệm Yếu tố ảnh Yếu tố ảnh hƣởng Các mức của thí nghiệm Khoảng biến thiên Mức dƣới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên +1 Nhiệt độ (x1) 19 20 21 1 Điều kiện (x2) A B Ánh sáng (x3) 53,6
Trong đó: A: Chai nƣớc biển với nút bông B: Chai nƣớc biển với màn lọc khí.
Hệ số tƣơng tác bi, bij đƣợc tính theo công thức: (với N = 16)
bj = ∑ ( ) b12= ∑ ( ) b123= ∑ ( )
Từ đó xác định đƣợc phƣơng trình hồi quy mô tả thực nghiệm.
Tối ưu hóa và thiết kế thí nghiệm
Sàng lọc yếu tố có ý nghĩa: từ kết quả nghiên cứu trƣớc đó có liên quan môi trƣờng đƣợc chọn có thành phần bao gồm: Nhiệt độ (x1), điều kiện thoáng khí (x2) và ánh sáng (x3).
Ba yếu tố từ kết quả sàng lọc thu đƣợc đƣợc xác định giá trị tối ƣu và đƣợc nghiên cứu ở 3 mức (-1, 0 và +1) (bảng 2) với 15 thí nghiệm trong đó có 3 thí nghiệm ở tâm.
Bảng 2.2: Bảng bố trí ma trận các nghệm thức thực nghiệm
TT
Biến mã hoá Biến thực
Y1:Số vi củ (Vi củ/mẫu X1 X2 X3 Z1: Nhiệt độ (oC) Z2: Điều kiện thoáng khí Z3:Ánh sáng (µmol m-2s-1) 1 1 -1 0 21 A 53,6 2 1 1 0 21 B 53,6 3 -1 1 0 19 B 53,6 4 1 -1 0 21 A 53,6 5 1 1 0 21 B 53,6 6 1 1 0 21 B 53,6 7 -1 1 0 19 B 53,6 8 -1 -1 0 19 A 53,6 9 -1 -1 0 19 A 53,6 10 1 -1 0 21 A 53,6 11 -1 1 0 19 B 53,6 12 -1 -1 0 19 A 53,6 13 0 -1 0 20 A 53,6 14 0 -1 0 20 A 53,6 15 0 -1 0 20 A 53,6