CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5 PHƢƠNG PHÁP LẤY SỐ LIỆU
Số vi củ hình thành (vi củ/mẫu): đếm số vi củ hình thành trên một mẫu cấy.
Khối lƣợng tƣơi của vi củ (g): đƣợc xác định bằng cách cân khối lƣợng tƣơi của vi củ hình thành.
Đƣờng kính vi củ (cm): đƣợc xác định bằng thiết bị đo đƣờng kính. 2.6 PHÂN TÍCH VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
Các thí nghiệm đều đƣợc bố trí theo kiểu thí nghiệm đơn yếu hoàn toàn ngẫu nhiên. Số liệu đƣợc ghi nhận và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel và xử lý thống kê theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai (ANOVA), kết quả phân hạng theo Duncan bằng chƣơng trình SAS 9.1.
Số liệu đƣợc trình bày bằng biểu đồ và bảng trắc nghiệm phân hạng. Xử lý bài toán tối ƣu bằng phần mềm MODDE 5.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 NỘI DUNG 1: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA HÓA CHẤT NUÔI CẤY TRONG GIAI ĐOẠN HÌNH THÀNH VI CỦ SÂM NGỌC LINH TỪ NUÔI CẤY PHÔI SOMA
3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của Myo-inositol lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Trong thí nghiệm này, mẫu phôi soma đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung myo-inositol. Sau tám tuần theo dõi, nhận thấy mẫu phôi sâm cấy vào các môi trƣờng với các nồng độ myo-inositol khác nhau bắt đầu có sự thay đổi. Các chỉ tiêu theo dõi sau tám tuần nuôi cấy đƣợc quan sát và thể hiện qua bảng 3.1.
Bảng 3.1: Ảnh hƣởng của myo-inositol lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh
Nồng độ (g/l) Số vi củ Đƣờng kính vi củ (cm) Khối lƣợng tƣơi vi củ (g) Hình thái vi củ 0 0,27c 0,19a 0,03c Củ hình chóp nhọn, nhỏ, xanh 0,5 0,93b 0,25a 0,04bc Củ hình chóp nhọn, nhỏ, xanh 1 1,47a 0,28a 0,06a Củ hình chóp nhọn, to, xanh, chắc 1,5 1,07b 0,26a 0,05ab Củ hình chóp nhọn, nhỏ, hơi vàng 2 0,47c 0,21a 0,03c Củ hình chóp nhọn, nhỏ, vàng Ftính 51,80** 3,11ns 12,36** CV (%) 13,75 14,98 15,29
Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a, b, …) trong cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với α = 0,01 bằng phép thử Duncan’s test.
ns: không khác biệt; *: Sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức α = 0,05; **: Sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức α = 0,01.
Hình 3.1: Ảnh hƣởng của myo-inositol lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
a: 0 mg/l b: 0,5 mg/l c: 1 mg/l
d: 1,5 mg/l e: 2 mg/l.
Theo kết quả thống kê ở tất cả các nghiệm thức ở tám tuần cho thấy đã có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với α = 0,01. Về chỉ tiêu số vi củ, ở nghiệm thức đối chứng bổ sung 0 g/l myo-inositol cho số vi củ thấp nhất (0,27 vi củ/mẫu) sau đó tăng lên khi môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 0,5 g/l myo-inositol (0,93 vi củ/mẫu). Nghiệm thức bổ sung 1 g/l myo-inositol có số vi củ hình thành cao nhất (1,47 vi củ/mẫu), khi tiếp tục tăng nồng độ myo-
a
e
c b
inositol lên thì số vi củ tạo thành bắt đầu giảm dần (1,5 g/l myo-inositol với 1,07 vi củ/mẫu và 2 g/l myo-inositol với 0,47 vi củ/mẫu). Điều này cho thấy rằng các môi trƣờng bổ sung myo-inositol với nồng độ cao đã ức chế sự hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh. Tuy nhiên, nghiệm thức ở nồng độ 1 g/l myo-inositol cho số vi củ có khác biệt về mặt thống kê nhƣng không quá sai khác so với nghiệm thức ở các nồng độ 0,5 g/l và 1,5 g/l.
Đƣờng kính vi củ không có sự khác biệt về mặt thống kê ở các nghiệm thức có nồng độ myo-inositol khác nhau. Nghiệm thức cho đƣờng kính vi củ cao nhất ở nghiệm thức bổ sung 1 g/l myo-inositol (0,28 cm) và đạt thấp nhất ở nghiệm thức đối chứng (0,19 cm). Khi nồng độ myo-inositol tăng dần thì đƣờng kính vi củ tăng dần và cao nhất ở nồng độ 1 g/l với đƣờng kính vi củ là 0,28 cm, khi tiếp tục tăng nồng độ myo-inositol lên 1,5 g/l, 2 g/l thì đƣờng kính vi củ giảm lần lƣợt là 0,26 cm, 0,21 cm. Nghiên cứu của Sepahvand và cộng sự (2012) cũng cho thấy trên đối tƣợng GF677 (gốc ghép đào và hạnh nhân) ở 10 mg/l myo-inositol tăng nhanh sự hình thành chồi và chiều dài chồi [56]. Nghiên cứu của Mazri và cộng sự (2016) cho thấy nồng độ tối ƣu của myo-inositol cho sự tăng sinh chồi cây chà là Mejhoul là 2 g/l [57]. Những kết quả này phù hợp với kết quả thu đƣợc cho thấy myo-inositol có ảnh hƣởng đến sự hình thành vi củ.
Nồng độ myo-inositol khi bổ sung vào môi trƣờng ảnh hƣởng tƣơng đối đến khối lƣợng tƣơi vi củ. Nghiệm thức ở nồng độ 1 g/l myo-inositol cho thấy kết quả khối lƣợng tƣơi vi củ cao nhất là 0,06 g, các nghiệm thức ở nồng độ 0,5 g/l và 1,5 g/l myo-inositol cho kết quả khối lƣợng tƣơi vi củ lần lƣợt là 0,04 g và 0,05 g, nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức bổ sung 2 g/l myo- inositol cho kết quả khối lƣợng tƣơi vi củ thấp nhất 0,03 g, giữa hai ngiệm thức này không có sự khác biệt về mặt thống kê. Điều này cho thấy myo- inositol không ảnh hƣởng nhiều đến khối lƣợng tƣơi vi củ. Kết quả này tƣơng tự với kết quả của Đỗ Đăng Giáp và cộng sự (2012) nhận thấy ở nồng độ myo-inositol 100 mg/l làm gia tăng hệ số nhân chồi chuối Laba. Tuy nhiên, myo-inositol lại không có tác động đến sự gia tăng khối lƣợng tƣơi của chồi [36].
Kết quả thu nhận sau tám tuần nuôi cấy cho thấy số lƣợng hình thành cao nhất trong môi trƣờng có bổ sung 1 g/l myo-inositol. Kết quả tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của Kaul và Sabharwal (1975) nhận thấy có sự gia tăng chồi và rễ khi nuôi cấy cây Haworthia trong môi trƣờng có bổ sung myo-inositol [45]. Khi tiếp tục tăng dần nồng độ myo-inositol lên thì kết quả cho thấy các chỉ tiêu theo d i có xu hƣớng giảm dần.
Từ kết quả trên, có thể đƣa ra nhận định rằng môi trƣờng nuôi cấy bổ sung myo-inositol thì sẽ kích thích tăng trƣởng tế bào, đặc biệt ảnh hƣởng rõ rệt lên sự hình thành vi củ. Khi tiếp tục tăng nồng độ myo-inositol lên cao thì số vi củ mới hình thành giảm xuống. Nguyên nhân có thể là do myo-inositol liên quan đến sự lƣu trữ và vận chuyển một nhóm các hormone thực vật [43], mà khi nồng độ chất kích thích sinh trƣởng quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tƣợng ức chế ngƣợc trở lại, lúc này nó sẽ trở thành chất gây ức chế, không những gây ức chế trong việc hình thành chồi mà còn ảnh hƣớng đến sự sinh trƣởng và phát triển của mô cấy [58].
3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của adenine sulphate lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Các nghiệm thức có nồng độ adenine sulphate từ 0,5 g/l đến 2 g/l thì mẫu bị xốp, không có sự phát triển, mẫu bị đen và xuất hiện mẫu chết nhiều. Nguyên nhân là do ảnh hƣởng của adenin sulphate lên khả năng tạo phôi có thể do tính chất của cytokinin, khi có mặt adenin sulphate trong môi trƣờng, các chồi đơn sử dụng adenin sulphate làm tiền chất để tổng hợp ra cytokinin nội sinh, mà nồng độ cytokinin quá cao sẽ gây ức chế tạo chồi. Không những thế nồng độ cytokinin cao còn gây ức chế sự sinh trƣởng và phát triển của mô tế bào thực vật [59].
Tiến hành giảm nồng độ adenine sulphate xuống 10 lần thì các nghiệm thức có sự phát triển, tạo phôi nhƣng không có sự hình thành vi củ.
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của adenine sulphate lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh
Nồng độ (g/l) Số vi củ Đƣờng kính vi củ (cm) Khối lƣợng tƣơi vi củ (g) Hình thái vi củ 0 0,27 0,15 0,03 Củ hình chóp nhọn, nhỏ, xanh 0,05 0 0 0 Không hình thành vi củ 0,1 0 0 0 Không hình thành vi củ 0,15 0 0 0 Không hình thành vi củ 0,2 0 0 0 Không hình thành vi củ
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của adenine sulphate lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
a: 0 mg/l b: 0,05 mg/l c: 0,1 mg/l
d: 0,15 mg/l e: 0,2 mg/l.
Theo kết quả thu đƣợc ở nghiệm thức đối chứng có sự hình thành vi củ còn ở tất cả các nghiệm thức còn lại không có sự hình thành vi củ nhƣng có sự hình thành và phát triển phôi. Ở các nghiệm thức có bổ sung adenine sulphate thì phôi hình thành có màu nâu sữa, tuy nhiên 2 nghiệm thức bổ sung
a
e
c d
0,05 g/l và 0,1 g/l mẫu tƣơng đối chắc, khi tăng hàm lƣợng adenine lên 0,15 g/l và 0,2 g/l thì mẫu xuất hiện hiện tƣợng bị xốp, mọng nƣớc. Điều này có thể giải thích do adenin kích thích sự phát sinh phôi soma và phát sinh cơ quan, gia tăng sự sinh trƣởng của các đỉnh mô phân sinh biệt lập, bao gồm sƣ tăng nhanh của chồi nách trong nuôi cấy chồi và kích thích phát sinh chồi bất định gián tiếp từ mô sẹo hay trực tiếp từ mẫu cấy [59]. Trong thí nghiệm của Đỗ Đăng Giáp và cộng sự, adenin sulphate đƣợc thử nghiệm trong quá trình kích thích tạo phôi vô tính từ mô sẹo trên đối tƣợng cây cọc rào, đạt hiệu quả cao nhất ở nồng độ là 150 mg/l khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy [38]. Ngoài ra, việc sử dụng kết hợp adenine với BA cho kết quả tạo chồi tăng cao có thể đƣợc giải thích qua vai trò là tiền chất trong con đƣờng sinh tổng hợp cytokinin của adenine. Theo Shrivastava và Banerjee (2008) báo cáo rằng ảnh hƣởng của adenin sulphate lên khả năng hình thành chồi có thể do hiệu quả kết hợp với các cytokinin khác [60]. Nghiên cứu của Premkumar (2011) cho thấy sự cảm ứng tạo chồi trên mẫu lá non của S. dulcis thành công nhất trong môi trƣờng có bổ sung 1483,79 µM adenin sulphate [61].
3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của L-tyrosine lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Tại các nghiệm thức với nồng độ L-tyrosine từ 0,5 g/l đến 2 g/l thì mẫu xuất hiện hiện tƣợng bị đen, không có sự phát triển và xuất hiện mẫu chết nhiều. Cũng nhƣ adenine sulphate, L-tyrosin là amino acid đƣợc cung cấp để kích thích sự phát sinh hình thái, tăng cƣờng sự phát triển thân, lá dẫn đến chồi non phát triển. Tuy nhiên, việc sử dung L-tyrosin với nồng độ quá cao không những gây ức chế tạo chồi mà còn ức chế sự sinh trƣởng và phát triển của mô cấy.
Tiến hành giảm nồng độ L-tyrosine xuống 10 lần so với nồng độ ban đầu thì các nghiệm thức cho thấy có sự hình thành phôi nhƣng không có sự hình thành vi củ.
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của L-tyrosine lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh
Nồng độ (g/l) Số vi củ Đƣờng kính vi củ (cm) Khối lƣợng tƣơi vi củ (g) Hình thái vi củ 0 0,27 0,17 0,02 Củ hình chóp nhọn, nhỏ, xanh 0,05 0 0 0 Không hình thành vi củ 0,1 0 0 0 Không hình thành vi củ 0,15 0 0 0 Không hình thành vi củ 0,2 0 0 0 Không hình thành vi củ
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của L-tyrosine lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
a: 0 mg/l b: 0,05 mg/l c: 0,1 mg/l
d: 0,15 mg/l e: 0,2 mg/l.
Theo kết quả trình bày ở bảng 3.3 cho thấy nghiệm thức đối chứng có sự hình thành vi củ còn ở tất cả các nghiệm thức còn lại không có sự hình thành vi củ nhƣng có sự hình thành và phát triển phôi. Ở các nghiệm thức có bổ sung L-tyrosine thì phôi hình thành có màu nâu sữa, một số mẫu có màu nâu sậm, tuy nhiên 2 nghiệm thức bổ sung 0,05 g/l và 0,1 g/l mẫu tƣơng đối
e c
a b
chắc, khi tăng hàm lƣợng L-tyrosine lên 0,15 g/l và 0,2 g/l thì mẫu xuất hiện hiện tƣợng bị xốp, mọng nƣớc. Điều này có thể giải thích do tùy amino acid và hàm lƣợng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng sẽ có ảnh hƣởng đến sự hình thành vi củ. Theo nghiên cứu của Kumar và cộng sự (2010) cho thấy L- tyrosine hình thành chồi nhiều nhất trong số các amino acid đƣợc thử nghiệm ở 0,5 mg/l [62]. Bên cạnh đó, L-tyrosine đƣợc xem là nguồn nitrogen hữu cơ thƣờng sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào thực vật, đƣợc sử dụng để kích thích hình thái trong nuôi cấy tế bào. Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhƣng sự bổ sung các amino acid vào môi trƣờng nuôi cấy là để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Các amino acid đã đƣợc sử dụng làm nguồn nitơ hữu cơ trong nuôi cấy một số loài nhƣ cỏ linh lăng, ngô, cao lƣơng, dứa, lúa và các loại cây đơn tính khác để tăng cƣờng sự hình thành và tái sinh phôi soma [63];[64].
3.1.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của casein hydrolysate lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh lên khả năng hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
Sau tám tuần theo dõi, nhận thấy mẫu phôi sâm cấy vào các môi trƣờng với các nồng độ casein hydrolysate khác nhau bắt đầu có sự thay đổi. Các chỉ tiêu theo dõi sau tám tuần nuôi cấy đƣợc quan sát và thể hiện qua bảng 3.4.
Bảng 3.4 : Ảnh hƣởng của casein hydrolysate lên sự hình thành vi củ từ mẫu phôi soma sâm Ngọc Linh
Nồng độ (g/l) Số vi củ Đƣờng kính vi củ (cm) Khối lƣợng tƣơi vi củ (g) Hình thái vi củ 0 0,27d 0,18b 0,02c Củ hình chóp nhọn, nhỏ, xanh 0,5 0,87bc 0,26b 0,04bc Củ hình chóp nhọn, nhỏ, xanh 1 1,80a 0,37a 0,06a Củ hình chóp nhọn, to, xanh, chắc 1,5 1,13b 0,28b 0,05ab Củ hình chóp nhọn, nhỏ, hơi vàng 2 0,73c 0,20b 0,03bc Củ hình chóp nhọn, rất nhỏ, hơi vàng Ftính 51,29** 13,88** 17,75** CV (%) 14,23 13,35 15,06
Ghi chú: Những chữ cái khác nhau (a, b, …) trong cùng một cột biểu diễn sự khác biệt có ý nghĩa với α = 0,01 bằng phép thử Duncan’s test.
ns: không khác biệt; *: Sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức α = 0,05; **: Sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức α = 0,01.
Hình 3.4: Ảnh hƣởng của casein hydrolysate lên sự hình thành vi củ sâm Ngọc Linh
a: 0 mg/l b: 0,5 mg/l c: 1 mg/l
d: 1,5 mg/l e: 2 mg/l.
Theo kết quả thu đƣợc ở bảng 3.4 cho thấy, sau tám tuần nuôi cấy mẫu, tất cả các nghiệm thức đều hình thành vi củ. Kết quả thống kê ở tất cả các nghiệm thức sau tám tuần cho thấy sự khác biệt về chỉ tiêu số vi củ hình thành. Nghiệm thức đối chứng casein hydrolysate 0 g/l có số vi củ thấp nhất (0,27 vi củ/mẫu) sau đó tăng lên khi môi trƣờng nuôi cấy có bổ sung 0,5 g/l casein hydrolysate (0,87 vi củ/mẫu). Nghiệm thức có số vi củ hình thành cao nhất là ở nồng casein hydrolysate 1 g/l (1,80 vi củ/mẫu), khi tiếp tục tăng nồng casein hydrolysate lên thì số vi củ hình thành giảm (1,5 g/l casein hydrolysate có 1,13 vi củ/mẫu, 2 g/l casein hydrolysate với 0,73 vi củ/mẫu). Hàm lƣợng casein hydrolysate ở các nồng độ khác nhau đều có sự thay đổi về
d e
số lƣợng vi củ so với môi trƣờng đối chứng. Kết quả này tƣơng tự nghiên cứu của Saklani (2015) cho thấy việc bổ sung casein hydrolysate 100 mg/l vào môi trƣờng nuôi cấy đã làm tăng số lƣợng chồi của cây Elaeocarpus sphaericus [65].
Theo nhƣ bảng 3.4 cho thấy các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Đƣờng kính vi củ ở nghiệm thức có nồng độ casein hydrolysate 1 g/l cho kết quả đƣờng kính cao nhất là 0,37 cm, khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức ở các nồng độ khác (0 g/l, 0,5 g/l, 1,5 g/l và 2 g/l) cho đƣờng kính lần lƣợt là 0,18 cm, 0,26 cm, 0,28 cm và 0,20 cm, giữa các nghiệm thức này không có sự khác biệt về mặt thống kê.