A) Trước khi phản ứng sảy ra, B) Sau khi phản ứng sảy ra
Quá trình biểu hiện của gen rất rõ ràng và chính xác. Tỷ lệ khuẩn lạc mang gen quan tâm sống sót cao là do trong quá trình tái tổ hợp có sự tham gia của gen kháng kháng sinh và một gen thông minh được gọi là ccdB. Phản ứng LR tạo ra 4 sản phẩm, trong đó chỉ có một sản phẩm đúng và phát triển trong môi trường chọn lọc, còn 3 sản phẩm khác bao gồm sản phẩm phụ và vectơ đích có chứa gen ccdB sẽ bị chết trên môi trường chọn lọc [7].
A)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
1.4.2. Vectơ nhân dòng pENTRTMD/TOPO cloning
Vectơ pENTRTMD/TOPO cloning là một vectơ tách dòng hiệu quả cao thuộc hệ thống vectơ Gateway, vectơ này có đặc điểm chỉ cần 5 phút để gắn 1 sản phẩm phản ứng PCR đầu bằng vào vectơ tách dòng này. Sản phẩm PCR không cần xử lý bằng enzym giới hạn, không cần sử dụng enzym ligase, mà vẫn có tỷ lệ gắn đúng lớn hơn 90%. Một lý do để vectơ pENTR được lựa chọn làm vectơ tách dòng bởi vì nó giúp chuyển nguyên vẹn đoạn ADN được nhân dòng sang vectơ biểu hiện, điều đó giúp cho quá trình biểu hiện của gen trong vectơ, đơn giản và thuận lợi hơn [36].
Vectơ pENTR được tạo lên dựa trên những trình tự đặc biệt của vi khuẩn lambda [44], những trình tự này cho phép chuyển nhanh và chính xác một đoạn ADN quan tâm vào vectơ đích. Để biểu hiện một gen quan tâm bằng công nghệ Gateway, trong đó vectơ nhận là pENTR thông thường gồm một số bước sau:
1. Gắn gen quan tâm vào vectơ pENTR để tạo ra vectơ nhận.
2. Thực hiện phản ứng LR giữa vectơ nhận và vectơ biểu hiện được lựa chọn để chuyển gen quan tâm lên vectơ biểu hiện.
3. Biểu hiện cấu trúc gen quan tâm trong vật chủ thích hợp (ví dụ: động vật, nấm men, côn trùng hày vi khuẩn ...) và phân tích protein được tổng hợp.
Đặc điểm của vectơ pENTRTM
TOPO
Vectơ pENTRTM
/D-TOPO được dùng để nhân dòng nhanh và chính xác các sản phẩm PCR đầu bằng và làm vectơ nhận của hệ thống Gateway. Vectơ này có đặc điểm:
+ Trình tự attL1 và attL2 là trình tự tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực khuẩn thể lambda, trình tự này cho phép chuyển vùng gen quan tâm đã được gắn vào vectơ nhận lên vectơ đích [44].
+ Trình tự T7 promoter/priming site cho phép dịch mã trong phòng thí nghiệm và xác định trình tự đoạn xen.
+ Vị trí nhân dòng TOPO cho phép gắn nhanh và chính xác một gen lên vectơ nhân dòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21
+ Vectơ đích có chứa trình tự kết thúc phiên mã rrnB, trình tự này giúp ngăn chặn quá trình biểu hiện ra sản phẩm của gen trong vi khuẩn E. coli.
+ Vectơ nhận và vectơ biểu hiện có chứa gen kháng kanamycin, cho phép sàng lọc các chủng khuẩn chứa gen quan tâm trong vi khuẩn E. coli.
+ Trong vectơ nhận và vectơ biểu hiện có chứa vùng khởi đầu sao chép pUC, cho phép tạo nhiều bản sao của plasmid và bảo vệ plasmid trong E. coli.
Hoạt động của enzym Topoisomerase I trong vectơ nhận
Topoisomerase I được tách từ virus Vaccinia, chúng có đặc điểm: có 1 vị trí ADN mạch kép đặc biệt (CCCTT), và liên kết phosphodieste trên một mạch của vị trí này bị đứt gãy [55]. Năng lượng từ sự đứt gãy này được sử dụng để xây dựng một liên kết cộng hóa trị giữa đầu 3’ phosphate của mạch đơn với phần tyrosyl còn lại của topoisomerase I. Liên kết photpho -tyrosyl giữa ADN và enzyme có thể bị phá bỏ bởi đầu 5’ hydroxyl của sơi gốc. Sự đảo chiều của phản ứng và ngắt mạch được thực hiện dưới tác dụng của enzym topoisomerase [55]. Lợi dụng đặc điểm này chúng ta có thể nhân dòng sản phẩm PCR đầu bằng được tốt hơn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
22
Định hƣớng nhân dòng của vùng TOPO trong nhân dòng
Để gắn đoạn ADN mạch kép vào vị trí TOPO của vectơ nhận nhà sản xuất gắn thêm một trình tự mạch đơn vào đầu 3’ [16]. Trình tự mạch đơn này giống hệt với trình tự ADN đầu 5’ của vùng TOPO. Ý tưởng này được Invitrogent sử dụng và thiết lập lại bằng cách bổ xung 1 đoạn trình tự mở gồm 4 nucleotid (GTGG) vào vùng TOPO và gắn vào hầu hết các vectơ. Theo đó, để chèn gen quan tâm vào các vectơ nhận đó, người ta bổ sung 4 trình tự (CACC) vào mồi xuôi của phản ứng PCR. Sau đó sản phẩm tạo ra có đầu 5’ bổ sung với đầu 3’ trên vectơ tách dòng, nhờ chức năng gắn các bazơ của vùng TOPO sẽ làm cho sản phẩm PCR được ổn định trong vectơ nhận. Theo công nghệ này, đoạn ADN cần nhân có thể được nhân dòng rất nhanh với độ chính xác lên tới trên 90% [40].
Tối ƣu hóa phản ứng nhân dòng
Trong phản ứng gắn ADN lên vectơ nhận, tỷ lệ sản phẩm PCR/vectơ TOPO từ 0,5/1 đến 2/1 sẽ cho tỷ lệ gắn gen lên vectơ nhân dòng cao. Với những trường hợp sản phẩm phản ứng PCR có kích thước lớn hơn 1kb hoặc ít thì có thể kéo dài thời gian phản ứng để tăng tỷ lệ này [36].
1.4.3. Vectơ chuyển gen pB2GW7
Vectơ pB2GW7 là vectơ nhân tạo dùng để chuyển gen vào thực vật, vectơ này có kích thước là 10,882 kb có đặc điểm như sau:
Hình 1.7. Sơ đồ vectơ pB2GW7 [36]
+ Có promoter 35S và terminator 35S cho phép khởi đầu và kết thúc quá trình phiên mã của gen được gắn vào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23
+ Có trình tự LB và RB là trình tự biên trái và biên phải của vùng T- ADN, vùng này gồm 25 bp có cấu trúc lặp lại không hoàn toàn, có chức năng giúp cho quá trình chuyển T-DNA sang tế bào thực vật.
+ Có chứa gen bar, gen kháng thuốc trừ cỏ gốc phosphonothricin (PPT), chức năng để chọn lọc thực vật chuyển gen.
+ Trình tự attR1 và attR2 là trình tự tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực khuẩn thể lambda, có chức năng tạo vị trí tiếp nhận gen được chuyển sang từ vectơ nhận trong phản ứng LR.
+ Có chứa gen ccdB là một gen thông minh, gen này gây chết các tế bào chứa nó trong môi trường có kháng sinh kanamycin
1.5. Vi khuẩn B. thuringiensis và gen cry
1.5.1. Những nghiên cứu chung về B. thuringiensis
Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) là một loại vi khuẩn đất được tìm thấy tại Nhật Bản vào năm 1901 [38] và ở Đức vào năm 1911 [26]. Sau đó chúng được tìm thấy ở nhiều nơi khác như đất rừng, cát bụi, phân rơi, nước biển, xác côn trùng. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí hình que, gram dương, có khả năng hình thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi [47]. Vi khuẩn này sản xuất ra các protein tinh khiết rất độc đối với ấu trùng của nhiều loài côn trùng nhưng không độc với động vật có xương sống (động vật có vú, chim, cá ...) [20]. Vi khuẩn này có thể sản sinh ra bốn loại độc tố hại côn trùng khác nhau: ngoại độc tố α, β, γ toxin và nội độc tố δ toxin. Trong đó nội độc tố δ toxin là quan trọng nhất. Tinh thể protein do vi khuẩn này tạo ra sau khi xâm nhập vào côn trùng sẽ bị các protease trong ruột côn trùng phân giải thành các đoạn nhỏ trong đó có đoạn mang khối lượng phân tử là 68.000 dalton chứa gần 1200 aminoaxit có hoạt tính độc gây hỏng ruột côn trùng. Năm 1984, Stahly đã tách được gen mã hóa protein này (Bt toxin) [22]. Các gen này thường định vị trên plasmid của vi khuẩn và gọi tên chung là gen ICP
(Insecticidal Crystal protein) [22]. Do vi khuẩn B. thuringiensis là vi khuẩn phức tạp có hơn 30 serotype nên chúng có chứa các gen ICP khác nhau và tạo nên những nhóm độc tố khác nhau [22].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
Do vi khuẩn này có khả năng diệt côn trùng tốt, nên đến từ những năm 1970 vi khuẩn này đã đươc nghiên cứu tạo ra chế phẩm để diệt sâu và được gọi là chế phẩm Bt. Chế phẩm này được dùng để diệt nhiều loại sâu hại khác nhau như bộ cánh cứng, bộ hai cánh, bộ cánh vẩy, bộ cánh màng ... với hiệu lực khá mạnh [20]. Mặc dù được coi là thuốc trừ sâu hiệu quả cao và an toàn, nhưng nó cũng có một số hạn chế nhất định về phương diện sinh học như thời gian ảnh hưởng ngắn hiệu quả tác động chậm, không tiếp xúc được với côn trùng ẩn sâu dưới lá, đất. Điều đó đã phần nào làm giảm mức độ sử dụng của chế phẩm này. Những nhược điểm này hoàn toàn bị loại trừ khi người ta chuyển gen cry vào cây trồng để tạo cây trồng kháng sâu [22]. Tiếp đó, từ năm 1996 đến nay có rất nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng sâu được tạo ra như: lúa, ngô, đậu tương, bông, ... [39].
1.5.2. Những nghiên cứu về gen cry
Năm 1982, Held đã đề nghị sử dụng chữ viết tắt “cry” (Crystal) để chỉ các gen tạo tinh thể độc tố của B. thuringiensis. Dựa trên tác động chuyên biệt và sự tương đồng về trình tự, gen tạo protein độc tố có thể được chia làm sáu nhóm chính và được ký hiệu từ cryI đến cryVI. Trong mỗi nhóm lại có các nhóm phụ được ký hiệu theo chữ cái từ A đến G [20].
Gen cryI mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước từ 130 - 140 kDa gây hại cho sâu bộ cánh vẩy (Lepidoptera), điển hình như loài sâu quấn lá, sâu đo, sâu róm, sâu đục gân lá ...
Gen cryII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 66 kDa gây hại cho sâu bộ cánh vẩy và bộ hai cánh (Diptera), điển hình như ruồi đục quả.
Gen cryIII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 73 kDa gây độc tính lên ấu trùng bộ cánh cứng Coleoptera, gồm các loại sâu như câu cấu, xén tốc đục thân, bọ dừa ...
Gen cryIV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 72, 74, 128 và 135 kDa có tác dụng gây hại ấu trung bộ hai cánh.
Gen cryV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 80 kDa có tác dụng gây hại ấu trùng bộ cánh vẩy và bộ cánh cứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
1.5.3. Những nghiên cứu về gen cryIA
Gen cryIA(c) là gen mã hóa cho protein gây độc cho côn trùng. Trong tự nhiên gen này có nguồn gốc từ vi khuẩn B. thuringiensis [20]. Gen này đã được các nhà khoa học phân lập, mang đi giải trình tự và chỉ ra rằng chúng có kích thước là 3,534 kb. Từ sau khi trình tự gen cryIA(c) được công bố trên ngân hàng gen có nhiều công trình nghiên cứu khác được thực hiện nhằm xây dựng những hệ thống vectơ mang gen này để chuyển vào cây trồng, đánh giá khả năng biểu hiên của gen này trên cây trồng. Năm 1997, Wu và cộng sự đã chuyển thành công gen cryIA(b) vào cây lúa [60]. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ sâu chết có thể lên tới 100% khi cho sâu ăn lá cây chuyển gen [60]. Năm 2002, Bhattacharya đã chuyển thành công gen cryIA(b) lên cây bắp cải [12]. Khi tiến hành nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng, Olsen chỉ ra rằng gen cryIA(c) không những giúp cây trồng có khả năng kháng sâu mà nó còn giúp cây trồng có khả năng thích nghi hơn với điều kiện nhiệt độ thay đổi [50]. Khi nghiên cứu khả năng biểu hiên gen cryIA(c) trên cây thuốc lá chuyển gen, Gulbitti đã chỉ ra rằng mức độ tích lũy protein cryIA(c) tăng lên trong giai đoạn hậu bị thương [32].
Ở Việt Nam, các nghiên cứu chuyển gen tạo cây trồng kháng sâu cũng đã và đang được thực hiện. Năm 1997, trong nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen, Trần Thị Phương Liên đã tạo thành công cây thuốc lá có khả năng kháng sâu [4]. Năm 2001, trong công trình nghiên cứu của mình, Đặng Trọng Lương đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen mang gen cryIA(c) và đánh giá được khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ đó trên cây bắp cải [5].
1.6. Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana
1.6.1. Đặc điểm nông sinh học cây A. thaliana
Cây A. thaliana được tìm thấy ở vùng có khí hậu ôn đới như Châu Âu, Đông Phi, Đông nam Á, Nhật bản, Bắc Mỹ và Châu Úc. Chúng là cây thuộc họ cải có hoa thập tự, có bộ nhiễm sắc thể nhỏ (2n =10). Trong tự nhiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
chúng thường mọc ở những nơi đất khô cằn, hoang mạc, đất nhiều đá như bãi đất hoang, bãi đỗ xe, đường tránh tàu [28].
Mặc dù không mang lại giá trị kinh tế cho con người, nhưng với một số đặc điểm như: kích thước nhỏ, chu kỳ sinh trưởng ngắn, hệ gen nhỏ, có nhiều hạt và dễ đột biến nên cây Arabidopsis mang lại ý nghĩa lớn trong khoa học như nghiên cứu về di truyền, phân tích học thuyết về sinh học phân tử [28].
Cây A. thaliana thích hợp với cường độ chiếu sáng cao khoảng 10.000 lux, nhiệt độ môi trường từ 18 – 28oC, nhiệt độ tối thích là 22oC. Khi gặp điều kiện nhiệt độ 4o
C trong vòng 1-5 ngày hạt cây sẽ nảy mầm [28]. 1.6.2. Những nghiên cứu về cây A. thaliana
Cây A. thaliana có hệ gen nhỏ, có vòng đời ngắn, cho nhiều hạt, có nhiều dạng đột biến. Đây chính là những đặc điểm quý được nhiều nhà khoa học quan tâm và tập trung nghiên cứu.
Năm 1993, Bechtold đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào cây A. thaliana bằng phương pháp hút chân không. Kết quả chỉ ra rằng một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tỷ lệ chuyển gen là giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây. Cũng trong nghiên cứu này ông chỉ ra môi trường thích hợp cho quá trình chuyển gen vào cây A. thaliana bao gồm dung dịch MS, Vitamin, BAP và đường [10].
Năm 1994, Chang đã nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana và chỉ ra rằng giai đoạn cho tỷ lệ chuyển gen cao nhất là khi cây có nhiều nụ (chưa nở hoa) [15].
Năm 1998, Clough nghiên cứu những phương pháp chuyển gen đơn giản vào cây A. thaliana thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã đưa ra một số nhận xét: Để thu được nhiều hoa và hiệu quả chuyển gen cao, tiến hành cắt đợt hoa đầu tiên và chờ đến khi ngồng hoa dài từ 2 – 10 cm và có nhiều nụ hoa mới tiến hành chuyển gen [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Trong nghiên cứu này ông nhận thấy: sự điều chỉnh pH của môi trường về 5,7 không ảnh hưởng gì đến tỷ lệ chuyển gen so với đối chứng không điều chỉnh; chất kích thích sinh trưởng BAP có ảnh hưởng khá rõ đến tỷ lệ chuyển gen vào A. thaliana, khi không bổ sung BAP vào môi trường biến nạp sẽ làm giảm tỷ lệ chuyển gen đi một nửa so với đối chứng có bổ sung BAP. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP lân gấp 1000 lần (44 mM) lại gây bất lợi cho quá trình chuyển gen và làm cho tỷ lệ chuyển gen giảm đi 5- 8 lần; đường có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen, quá trình chuyển gen gần như không xảy ra hoặc xảy ra với tỷ lệ chuyển gen rất thấp nếu không có đường trong môi trường biến nạp [14].
Khi tiến hành so sánh hiệu quả chuyển gen của phương pháp sử dụng chất hoạt động bề mặt Silwet L-77 với phương pháp hút chân không, CloughS nhận thấy khi tăng nồng độ Silwet L-77 từ 0,005% lên 0,1% thì tỷ lệ chuyển gen bằng phương pháp này cao hơn phương pháp hút chân không [14].