3. Nội dung nghiên cứu
1.6.1. Đặc điểm nông sinh học cây A thaliana
Cây A. thaliana được tìm thấy ở vùng có khí hậu ôn đới như Châu Âu, Đông Phi, Đông nam Á, Nhật bản, Bắc Mỹ và Châu Úc. Chúng là cây thuộc họ cải có hoa thập tự, có bộ nhiễm sắc thể nhỏ (2n =10). Trong tự nhiên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
chúng thường mọc ở những nơi đất khô cằn, hoang mạc, đất nhiều đá như bãi đất hoang, bãi đỗ xe, đường tránh tàu [28].
Mặc dù không mang lại giá trị kinh tế cho con người, nhưng với một số đặc điểm như: kích thước nhỏ, chu kỳ sinh trưởng ngắn, hệ gen nhỏ, có nhiều hạt và dễ đột biến nên cây Arabidopsis mang lại ý nghĩa lớn trong khoa học như nghiên cứu về di truyền, phân tích học thuyết về sinh học phân tử [28].
Cây A. thaliana thích hợp với cường độ chiếu sáng cao khoảng 10.000 lux, nhiệt độ môi trường từ 18 – 28oC, nhiệt độ tối thích là 22oC. Khi gặp điều kiện nhiệt độ 4o
C trong vòng 1-5 ngày hạt cây sẽ nảy mầm [28]. 1.6.2. Những nghiên cứu về cây A. thaliana
Cây A. thaliana có hệ gen nhỏ, có vòng đời ngắn, cho nhiều hạt, có nhiều dạng đột biến. Đây chính là những đặc điểm quý được nhiều nhà khoa học quan tâm và tập trung nghiên cứu.
Năm 1993, Bechtold đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào cây A. thaliana bằng phương pháp hút chân không. Kết quả chỉ ra rằng một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tỷ lệ chuyển gen là giai đoạn sinh trưởng phát triển của cây. Cũng trong nghiên cứu này ông chỉ ra môi trường thích hợp cho quá trình chuyển gen vào cây A. thaliana bao gồm dung dịch MS, Vitamin, BAP và đường [10].
Năm 1994, Chang đã nghiên cứu chuyển gen vào cây A. thaliana và chỉ ra rằng giai đoạn cho tỷ lệ chuyển gen cao nhất là khi cây có nhiều nụ (chưa nở hoa) [15].
Năm 1998, Clough nghiên cứu những phương pháp chuyển gen đơn giản vào cây A. thaliana thông qua vi khuẩn A. tumefaciens đã đưa ra một số nhận xét: Để thu được nhiều hoa và hiệu quả chuyển gen cao, tiến hành cắt đợt hoa đầu tiên và chờ đến khi ngồng hoa dài từ 2 – 10 cm và có nhiều nụ hoa mới tiến hành chuyển gen [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Trong nghiên cứu này ông nhận thấy: sự điều chỉnh pH của môi trường về 5,7 không ảnh hưởng gì đến tỷ lệ chuyển gen so với đối chứng không điều chỉnh; chất kích thích sinh trưởng BAP có ảnh hưởng khá rõ đến tỷ lệ chuyển gen vào A. thaliana, khi không bổ sung BAP vào môi trường biến nạp sẽ làm giảm tỷ lệ chuyển gen đi một nửa so với đối chứng có bổ sung BAP. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP lân gấp 1000 lần (44 mM) lại gây bất lợi cho quá trình chuyển gen và làm cho tỷ lệ chuyển gen giảm đi 5- 8 lần; đường có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen, quá trình chuyển gen gần như không xảy ra hoặc xảy ra với tỷ lệ chuyển gen rất thấp nếu không có đường trong môi trường biến nạp [14].
Khi tiến hành so sánh hiệu quả chuyển gen của phương pháp sử dụng chất hoạt động bề mặt Silwet L-77 với phương pháp hút chân không, CloughS nhận thấy khi tăng nồng độ Silwet L-77 từ 0,005% lên 0,1% thì tỷ lệ chuyển gen bằng phương pháp này cao hơn phương pháp hút chân không [14].
Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch khuẩn trong môi trường biến nạp đến tỷ lệ chuyển gen, tác giả chỉ ra rằng nồng độ dịch khuẩn có OD=0,8 sẽ cho tỷ lệ chuyển gen đạt cao nhất [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α và tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
chủng EHA105 do Trường Đại học Đông A - Hàn Quốc cung cấp.
- Vectơ nhân dòng pENTRTM/D-TOPO và vectơ chuyển gen pB2GW7 do hãng Invitrogen cung cấp.
- Gen cryIA(c) trong vectơ OB-Mutant#16-cryIA(c) là kết quả hợp tác nghiên cứu giữa trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Đông A và Đại học Seoul - Hàn Quốc.
- Cây thử nghiệm: A. thaliana.
- Mồi sử dụng để nhân gen do hãng COSMO Genetech cung cấp gồm:
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Trình tự
cryIA(c) - F CAC CAT GGA CAA CAA CCC AAA CAT CAA
cryIA(c) - R TTA AAG ATT GTA CTC AGC CTC AAG AGT
bar - F ATC AGC TTG CAT GCC GGT CGA TCT AG
bar - R TAT CAT ACA TGA GAA TTA AGG GAG TC
Mồi xuôi của phản ứng nhân gen cryIA(c) có đặc điểm chứa trình tự CACC ở đầu 5’. Đây là trình tự rất cần thiết cho quá trình gắn sản phẩm PCR lên vectơ nhân dòng. Sau khi sản phẩm PCR tạo ra có đầu 5’ bổ sung với đầu 3’ trên vectơ tách dòng và nhờ chức năng gắn các bazơ của vùng TOPO sẽ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
làm cho sản phẩm PCR được ổn định trong vectơ nhân dòng. Mồi ngược của phản ứng nhân gen cryIA(c) và mồi nhân gen bar có trình tự bổ sung với gen cần nhân.
2.1.2. Hóa chất sử dụng trong đề tài
- Môi trường LB dùng cho nuôi khuẩn E.coli gồm Bacto Trypton (Merk), Yeast Extract (Oxoid), Agar (Hạ Long)
- Môi trường YEP dùng cho nuôi khuẩn A. tumefaciens gồm Bacto Pepton (Oxoid), Yeast Extract (Oxoid), Agar (Hạ Long)
- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR là bộ kít PCR Master mix 2X của Fermentas
- Hóa chất sử dụng tách plasmid: bộ kít tách plasmid GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit (Fermentas)
- Hóa chất sử dụng tách ADN từ bản gel điện di: bộ kít GeneJET™ Gel Extraction Kit (Fermentas)
- Hóa chất dùng cho phản ứng gắn nối sản phẩm PCR vào vectơ tách dòng pENTR bao gồm dung dịch muôi NaCl và MgCl2 được cung cấp bởi hãng Invitrogen.
- Hóa chất dùng cho phản ứng chuyển gen cryIA(c) lên vectơ pB2GW7 bao gồm: đệm TE pH 8,0, dung dịch enzym LR clonase II và dung dịch enzym proteinase K được cung cấp bởi hãng Invitrogen
- Hóa chất sử dụng trong chạy điện di ADN: Agarose (Bio-Canada), đệm TAE (Tris base (Merk), EDTA (Merk), NaOH, Acid acetic 100% (Merk)), Loading dye (Intronbio), Ethidium bromide (Canada).
- Enzym giới hạn được sử dụng trong đề tài là enzym SacI được cung cấp bởi hãng Fermentas
- Hóa chất sử dụng cho môi trường đồng nuôi cấy bao gồm : MS (phụ lục 3), BAP (Merk), Sucrose (Việt Nam)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30
2.1.3. Thiết bị sử dụng trong đề tài - Bộ điện di DNA (Mupid 2 plus) - Bộ điện di DNA (Mupid 2 plus) - Cân phân tích Sartorius TE214S - Máy lắc SK 300
- Máy vortex IKA ZX3 - Micropipet Gilson
- Tủ lạnh 4ºC (HITACHI) tủ lạnh -20ºC (DAEWOO) và -80ºC (Sanyo) - Bể ổn nhiệt (Labtech)
- Tủ cấy vô trùng (Esco)
- Máy ly tâm MIKRO 22 (Hettich zentrifugen) - Máy ly tâm loại nhỏ (Hanil)
- Máy spindown (Hanil)
- Máy PCR EG3200 (Thermocycle)
- Máy xác định trình tự tự động AB 3130 (HITACHI) - Máy hút chân không (Wech)
- Máy chụp ảnh gel Logic 1500 (Kodak) - Lò vi sóng (LG)
- Nồi khử trùng TLG (Đức)
Ngoài ra đề tài còn sử dụng một số thiết bị khác có xuất xứ từ những nước phát triển như Đức, Nhật, Hàn Quốc ... những thiết bị này có độ chính xác cao.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Nhân dòng gen cryIA(c) từ vectơ OB-Mutant#16-cryIA(c)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
Hình 2.1. Sơ đồ nhân dòng gen cryIA(c) bằng vectơ pENTR
2.2.1.1. Nhân gen cryIA(c) từ vectơ pOB-Mut-cryIA(c)
Gen cryIA(c) được nhân dòng từ vectơ pOB-Mutant#16-cryIA(c) bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cryIA(c) -F và cryIA(c) – R [48]. Phản ứng tiến hành với thể tích 50 μl, đựng trong ống eppendorf 0,2 ml bao gồm các thành phần:
+
Gắn nối PCR với mồi đặc hiệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 Nước khử ion 10X buffer 10X dNTP cryIA(c) - F cryIA(c) - R ADN khuôn (50 ng/µl) Taq polymerase 32,5 µl 5 µl 5 µl 2 µl 2 µl 3 µl 0,5 µl Chu trình nhiệt cho phản ứng được đặt như sau
95oC trong 5 phút 95 oC 45 trong giây
55 oC 45 trong giây 30 chu kỳ 72 oC trong 60 giây
72 oC trong 7 phút
2.2.1.2. Gắn gen cryIA(c) lên vectơ tách dòng pENTR™/D-TOPO®.
Sản phẩm PCR ở thí nghiệm trên được gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pENTR TM/D - TOPO, thành phần phản ứng gắn nối gồm: 1 µl dung dịch đệm TOPO 6X, 4 µl sản phẩm phản ứng PCR, 1 µl vectơ tách dòng pENTRTM/D - TOPO. Phản ứng gắn nối thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α khả biến theo phương pháp sốc nhiệt ở 42o
C [30].
2.2.1.3. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc thu được sau nhân dòng với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Khuẩn lạc E. coli chứa vectơ tái tổ hợp pENTR-cryIA(c) được chọn lọc trên môi trường LB chứa kanamycin 100 mg/lít. Kiểm tra hiện diện của của gen cryIA(c) trong các chủng khuẩn bằng phương pháp PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cryIA(c)-F và cryIA(c)-R. Thành phần phản ứng và chu kỳ phản ứng tương tự như phần 2.2.1.1
2.2.1.4. Xác định trình tự đoạn ADN được nhân dòng
Sau khi đã chọn được các dòng khuẩn lạc mang gen cryIA(c) bằng phương pháp PCR, nuôi riêng các dòng khuẩn lạc đó trên môi trường lỏng có bổ sung kanamycin 100 mg/l, tách plasmid và xác định trình tự gen cryIA(c)
bằng phương pháp dideoxy của Sanger [53] trên máy giải trình tự tự động (autosequencer). Kết quả giải trình tự được phân tích trên phần mềm PC/gene.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
Sau khi đã có trình tự gen cryIA(c) tiến hành so sánh trình tự đó với trình tự gen được cung cấp và so sánh với ngân hàng gen để phân tích sự tương đồng.
2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c)
Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c) được tiến hành theo hình 2.2.
Hình 2.2. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ
pB2GW7-cryIA(c)
+
Thực hiện phản ứng LR
Thực hiện phản ứng sung điện với vi khuẩn A. tumefaciens
A. tumefaciens
cryIA(c)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
34
2.2.2.1. Gắn gen cryIA(c) lên vectơ chuyển gen pB2GW7 Gen cryIA(c) được chuyển từ vectơ pENTRTM
/D-TOPO-cryIA(c) sang vectơ pB2GW7 nhờ phản ứng LR. Để Thưc hiện một phản ứng LR tiến hành qua các bước sau [36]:
1) Thành phần phản ứng gồm pENTR-cryIA(c) (150 ng/µl) pB2GW7 (150 ng/µl) Đệm TE pH 8,0 1 µl 1 µl 6 µl
2) Đặt dung dịch enzym LR clonaseTM II vào trong đá trong 2 phút, sau đó lắc đều trước khi sử dụng.
3) Bổ sung 2 µl dung dịch enzym LR clonaseTMII vào hỗn hợp trên 4) Để phản ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng (25oC) trong 1 giờ 5) Bổ sung 1 µl dung dịch Proteinase K, đảo đều và để ở 37o
C trong 10 phút.
Sau khi có được vectơ pB2GW7-cryIA(c) bằng phản ứng trên, tiến hành biến nạp vectơ này vào tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α khả biến bằng phản ứng sốc nhiệt ở 42o
C [36]. Phương pháp tiến hành như sau:
1) Lấy 2 µl sản phẩm phản ứng LR ở trên cho vào một ống tế bào khả biến E. coli chủng DH5α.
2) Đặt ống chứa hỗn hợp trên vào đá lạnh trong 30 phút 3) Thực hiện phản ứng sốc nhiệt trong 30 giây ở 42oC 4) Chuyển nhanh ống trên vào trong đã
5) Bổ sung 250 µl môi trường LB lỏng vào hỗn hợp trên 6) Đặt ống trên vào tủ 37oC nuôi lắc trong 1 giờ
7) Lấy 100 µl dung dịch sau nuôi lắc cấy trải lên môi trường chứa kháng sinh spectinomycin 50 mg/l và nuôi ở 37oC qua đêm và chọn 9 khuẩn lạc đem phân tích.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
35
2.2.2.2. Phân tích các dòng tế bào E. coli thu được sau chọn lọc
Kiểm tra sự hiện diện của gen cryIA(c) trong vectơ chuyển gen bằng hai cách :
1) PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) được tiến hành tương tự như phần 2.2.1.1
2) Cắt vectơ tái tổ hợp bằng enzym cắt giới hạn SacI được tiến hành với các thành phần như sau Nước cất khử ion Dung dịch đệm 10X Vectơ pB2GW7-cryIA(c) Enzym SacI 16 µl 2 µl 1 µl 1 µl
Đảo đều từ 3 đến 5 lần và ly tâm trong vài giây, đặt ở 37oC trong 16 giờ, sau đó điện di trên bản gel agarose 1% để kiểm tra.
2.2.2.3. Biến nạp vectơ pB2GW7-cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A. tumefacicens
Nhặt tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α mang vectơ pB2GW7-
cryIA(c) nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, tách plasmid và chuyển vào chủng vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương pháp sung điện [36]. Phương pháp được tiến hành như sau:
1) Lấy 2 µl vectơ pB2GW7-cryIA(c) và 50 µl tế bào vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 khả biến cho vào cuvettes 0,1 cm, đặt cuvettes vào máy tạo sung điện.
2) Tiến hành sung điện với hiệu điện thế 12,5 kV, cường độ dòng điện 25 µF trong thời gian 8 – 12 phần nghìn giây.
3) Chuyển toàn bộ hỗn hợp trên sang ống eppendorf 1,5 ml và bổ sung vào đó 250 µl dung dịch S.O.C
4) Nuôi lắc hỗn hợp trên ở 37oC trong 1 giờ
5) Cấy trải 50 µl hỗn hợp sau nuôi cấy lên đĩa môi trường YEP có bổ sung spectinomycin 50 mg/l và rifampicin 25 mg/l.
6) Nuôi ở 37oC qua đểm, sau đó tiến hành chọn 10 khuẩn lạc đem phân tích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36
2.2.2.4. PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Sau khi nuôi cấy qua đêm, chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc đem phân tích bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Thành phần phản ứng và chu kỳ phản ứng tương tự như phần 2.2.1.1.
2.2.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7-
cryIA(c) trên cây A. thaliana
2.2.3.1. Tạo cây A. thaliana chuyển gen
Hình 2.3. Sơ đồ tạo cây A. thaliana chuyển gen
Gieo và chăn sóc trong điều kiện ngày ngắn đến khi ra hoa
Hút chân không trong 30 giây
Ly tâm thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch đồng nuôi cấy Hạt A. thaliana đã
được xử lý này mầm
Cây A. thaliana
nở hoa
A. tumefaciens được nuôi trong môi trường
YEP 48 giờ Dung dịch đồng nuôi cấy + vi khuẩn A. tumefaciens Hạt A. thaliana chuyển gen + Nhúng hoa trong 30 giây Trồng, chăm sóc trong nhà lưới tới khi có quả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
Cây A. thaliana được trồng trong điều kiện ngày ngắn (8 giờ sáng/ 16 giờ tối) tới khi cây ra hoa. Sau đó, tiến hành chuyển gen vào hoa theo phương pháp nhúng hoa [14]. Hoa được ngâm trong dụng dịch đồng nuôi cấy (MS/2 pH 5,7, BAP 44 mM, sucrose 5%) có OD = 0,8 trong 30 giây, hút chân không 30 giây. Sau đó cây được đặt trong bình kín 3 ngày. Cứ 6 ngày chuyển gen lặp lại một lần. Khi quả trên cây chín tiến hành thu hạt và xử lý này mầm ở 4oC trong 5 ngày trước khi gieo.
2.2.3.2. Đánh giá cây Arabidopsis chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc diệt cỏ
Sau khi có được hạt cây A. thaliana chuyển gen đem gieo trên môi trường MS/10 có bổ sung phosphinothricin (PPT) 3 mg/l, theo dõi số cây sống, số cây chết từ đó đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7-cryIA(c).
2.2.3.3. Đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar