3. Nội dung nghiên cứu
3.2.2. Kết quả phân tích các dòng tế bào E.coli thu được sau chọn lọc
Để kiểm tra sự tồn tại của gen cryIA(c) trong tế bào vi khuẩn E. coli sau chọn lọc, tiến hành chọn ngẫu nhiên 9 dòng khuẩn lạc, nuôi riêng trong môi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, thu sinh khối, tách plasmid và thực hiện phản ứng PCR với mồi đặc hiệu của gen cryIA(c), điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra. Kết quả được thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Kết PCR kiểm tra 9 dòng khuẩn lạc với mồi đặc hiệu của gen
cryIA(c)
M: Ladder 1 kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 9 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
Qua hình 3.7 cho thấy: Các đường chạy số 1 đến số 9 đều có 1 băng ADN có kích thước tương ứng với kích thước gen cryIA(c) (1,857 kb) trong khi đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất hiện băng đặc hiệu, kết luận 9 dòng đem phân tích đều có chứa gen cryIA(c).
Hình 3.8. Sơ đồ cấu tạo vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c)
A
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
47
Theo lý thuyết: trong gen cryIA(c) và vectơ pB2GW7 đều có 1 vị trí nhận biết của enzym SacI. Do vậy, khi cắt vectơ tái tổ hợp này bằng enzyme
SacI sẽ tạo 2 băng ADN có kích thước lần lượt là 8,741 kb và 2,547 kb.
Để chứng minh việc gắn gen cryIA(c) lên vectơ không làm thay đổi cấu trúc vectơ và gen, tiến hành cắt vectơ này bằng enzym SacI và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả thu được ở hình 3.9.
Hình 3.9. Kết quả cắt kiểm tra plasmid của 9 dòng khuẩn lạc bằng enzym SacI
M: Ladder 1 kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 9 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
Hình 3.9 cho thấy: Từ đường chạy số 1 đến số 9, đều xuất hiện 2 băng ADN: băng lớn có kích thước 8,7 kb và băng nhỏ có kích thước 2,5 kb, đường chạy đ/c (đối chứng) chỉ xuất hiện 1 băng duy nhất kích thước khoảng 10,8 kb. Vậy trong vectơ tái tổ hợp có chứa gen cryIA(c).
3.2.3. Kết quả biến nạp vectơ pB2GW7- cryIA(c) vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
Sau khi đã chọn được các dòng tế bào vi khuẩn E. coli chủng DH5α mang vectơ pB2GW7- cryIA(c), tiến hành nuôi riêng trong môi trường LB có bổ sung spectinomycin 50 mg/l, tách plasmid và chuyển sang tế bào vi khuẩn
A. tumefaciens chủng EHA105 bằng phương pháp sung điện. Sau đó, các dòng khuẩn lạc chứa vectơ pB2GW7-cryIA(c) được chọn lọc trên môi trường YEP có bổ sung spectinomycin 50 mg/l và rifampicin 25 mg/l. Kết quả thu được ở hình 3.10.
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48
Hình 3.10. Kết quả biến nạp vectơ pB2GW7-cryIA(c) vào vi khuẩn
A. tumefaciens
Qua hình 3.10 cho thấy có 549 dòng khuẩn lạc có khả năng sống trên môi trường chứa đồng thời hai kháng sinh spectinomycin và rifampicin. 3.2.4 Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Để kiểm tra sự tồn tại của gen cryIA(c) trong các dòng vi khuẩn A . tumefaciens sau biến nạp. Chúng tôi tiến hành chọn và thực hiện phản ứng PCR 10 khuẩn lạc thu được với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c). Kết quả điện di sản phẩm trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn lạc A. tumefaciens thu được sau biến nạp
M: Ladder 1 kb; đ/c: vectơ pB2GW7 (đối chứng); 1- 10 thứ tự các dòng khuẩn lạc phân tích
M đ/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1,6 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
49
Qua hình 3.11 cho thấy : Từ đường chạy số 1 đến đường chạy số 10 đều xuất hiện một băng ADN có kích thước 1,8 kb, tương đương kích thước gen
cryIA(c) (1,857 kb). Trong khi đó ở đường chạy đ/c (đối chứng) không có băn ADN xuất hiện. Điều đó khẳng định: tất cả các dòng khuẩn lạc phân tích đều chứa vectơ tái tổ hợp pB2GW7-cryIA(c) hay đã tạo thành công chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c).
3.3. Đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ pB2GW7-cryIA(c)
trên cây A. thaliana
3.3.1. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên khả năng kháng thuốc diệt cỏ
Theo thiết kế, trong vùng T-DNA của vectơ pB2GW7-cryIA(c) có chứa gen bar (gen kháng thuốc trừ cỏ phosphinothricin (PPT)) và gen cryIA(c). Do vậy, để đánh giá khả năng chuyển gen của hệ thống vectơ, thí nghiệm sử dụng 2 phương pháp: (1) phương pháp sử dụng môi trường có chứa chất chọn lọc PPT, (2) Phương pháp PCR gen bar và gen cryIA(c) với mồi đặc hiệu.
Để đánh giá khả năng hoạt động của gen bar trên cây A. thaliana chuyển gen, chúng tôi tiến hành trồng cây trên môi trường chứa 3mg PPT/l. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả chọn lọc cây A. thaliana trên môi trƣờng chọn lọc
Chỉ tiêu Công thức Số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu chết (mẫu) Tỷ lệ chết (%) Số mẫu sống (mẫu) Tỷ lệ sống (%) Hạt không chuyển gen 30 30 100,00 0 0,00 Hạt đã đươc chuyển gen 430 428 99,53 2 0,47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
50
Qua bảng số liệu cho thấy 100% mẫu cây ở công thức đối chứng (không có gen bar) đều chết sau chọn lọc. Ở công thức cây chuyển gen, thu đươc 2 cây sinh trưởng tốt và có hình thái bình thường. Như vậy có thể xác định 2 cây chuyển gen có chứa gen kháng PPT và tỷ lệ chuyển gen vào cây A. thaliana đạt 0,47 %.
Khi so sánh tỷ lệ chuyển gen ở trên với tỷ lệ chuyển gen của tác giả Clough và Cs [14] tiến hành cùng một phương pháp thấy: tỷ lệ cây chuyển gen thu được trong thí nghiệm thấp hơn tỷ lệ chuyển gen của CloughS. Nguyên nhân có thể là do sự sai khác về hóa chất sử dụng (hãng mua khác nhau) và chất lượng của thiết bị thí nghiêm.
3.3.2. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar
Phân tích 2 cây A. thaliana chuyển gen bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen bar sau đó điện di kiểm tra trên bản gel agarose 1%. Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen bar
M: Ladder 1 kb; đường chạy 1, 2: sản phẩm PCR ADN từ cây A. thaliana chuyển gen; đường chạy đ/c: sản phẩm PCR ADN từ cây không chuyển gen
(đối chứng)
1 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
Qua hình 3.12 cho thấy: đường chạy số 1 và 2 xuất hiện một băng ADN kích thước khoảng 1,1 kb tương đương với kích thước của gen bar (1,148 kb) trong khi đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất hiện băng đặc hiệu. Kết luận trong hệ gen của 2 cây chuyển gen có chứa gen bar.
3.3.3. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
Sau khi đã chọn lọc được cây A. thaliana có khả năng kháng thuốc trừ cỏ PPT, tiến hành tách ADN, thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c) và điện di trên gel agarose 1% thu được kết quả ở hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quả đánh giá cây A. thaliana chuyển gen dựa trên
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen cryIA(c)
M: Ladder 1 kb; đường chạy 1, 2: sản phẩm PCR ADN từ cây A. thaliana chuyển gen; đường chạy đ/c: sản phẩm PCR ADN từ cây không chuyển gen (đối chứng)
Qua hình 3.13 cho thấy: đường chạy số 1 và 2 xuất hiện một băng ADN kích thước khoảng 1,8 kb tương đương với kích thước của gen cryIA(c) trong khi đường chạy đ/c (đối chứng) không xuất hiện băng đặc hiệu. Kết luận trong hệ gen của 2 cây chuyển gen có chứa gen cryIA(c).
M 1 2 đ/c
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52
Từ hình 3.12 và 3.13 cho thấy toàn bộ phần T-DNA của vectơ pB2GW7-
cryIA(c) đã được chuyển vào cây A. thaliana hay đã tạo thành công cây A. thaliana chuyển gen mang đồng thời gen cryIA(c) và gen bar.
3.3.4. Đánh giá khả năng sinh trưởng của cây A. thaliana chuyển gen
Để đánh giá ảnh hưởng của gen được chuyển đến cây chuyển gen, tiến hành so sánh một số chỉ tiêu nông sinh học của cây chuyển gen với cây không chuyển gen. Kết quả thu được ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thống kê một số chỉ tiêu nông sinh học của cây chuyển gen so với cây đối chứng
Chỉ tiêu Công thức Thời gian sinh trưởng (ngày) Số lá/cây (lá) Số hoa/cây (hoa) Số quả/cây (quả) Tỷ lệ đậu quả (%) Số hạt/quả (hạt) Cây không chuyển gen 35 18,4 56,2 12,2 21,0 8,4
Cây chuyển gen 35 18,5 55,8 12,6 22,0 8,6
Qua bảng số liệu cho thấy không có sự khác biệt giữa cây chuyển gen và cây không chuyển gen ở các chỉ tiêu theo dõi. Điều này chứng tỏ gen được chuyển không gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây
A. thaliana chuyển gen, hệ thống vectơ này có thể sử dụng vào mục đích tạo cây trồng kháng sâu.
Tuy nhiên, xem xét các đặc điểm nông sinh học của cây A. Thaliana
(không được chuyển gen) trong thí nghiệm như tổng số quả trung bình/ cây, tổng số hạt/ quả, các chỉ tiêu trên thấp hơn so với thí nghiệm cùng loại của Fiona và cộng sự [28] . Sự sai khác có thể được giải thích là do điều kiện trồng và chăm sóc khác nhau tạo lên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Bằng phương pháp nhân gen với cặp mồi đặc hiệu và gắn gen lên vectơ tách dòng, chúng tôi đã tách dòng thành công gen cryIA(c) kích thước 1,857 kb, đây là một gen đột biến, hiện chưa được công bố trên ngân hàng gen.
Đã tạo được chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-
cryIA(c) có khả năng chuyển gen vào thực vật.
Xác định được tỷ lệ chuyển gen của chủng vi khuẩn A. tumefaciens
EHA105 mang vectơ pB2GW7-cryIA(c) vào cây A. thaliana là 0,47%.
2. Đề nghị
Tiếp tục đánh giá khả năng kháng các loại sâu của cây A. thaliana
chuyển gen
Tiếp tục đánh giá khả năng chuyển gen của chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vectơ pB2GW7-cryIA(c) trên các loại cây trồng khác
Tiếp tục nghiên cứu tạo ra những vectơ chuyển gen mới có khả năng chuyển gen tốt, gen mới có khả năng kháng sâu tốt để phục vụ công tác tạo cây trồng kháng sâu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
54
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Quốc Dung (2006), Công nghệ chuyển gen động vật và thực vật, Nhà xuất bản Đại học Huế, Huế.
2. Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hồ và Nguyễn Văn Uyển (2003), "Tạo cây hông (Paulownia fortune) chuyển gen kháng sâu thông qua vi khuẩn
Agrobacterium", Hội nghị Công ngệ sinh học toàn quốc 2003, tr. 1088 - 1090.
3. Lê Thị Thu Hiền, Nguyễn Thùy Dương, Đào Thị Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lê Trần Bình và Nông Văn Hải (2004), "Thiết kế vectơ thế hệ mới mang gen kháng côn trùng cryIA(c) để chuyển vào cây trồng", Tạp chí Công nghệ sinh học, 2 (1), tr. 85 - 92.
4. Trần Thị Phương Liên và Nông Văn Hải (1997), "Chuyển tổ hợp gen GUS- BNG vào cây thuốc lá", Tạp chí Khoa học và Công nghệ 2, tr. 23-27.
5. Đặng Trọng Lương, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống vàTrần Duy Quý (2001), "Nghiên cứu chuyển gen cryIA(c) kháng sâu vào một số giống cải bắp (Brassica oleracea var capitata) qua
Agrobacterium", Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 120-128.
6. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen vào thực vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
Tiếng Anh
7. Aaron, J. P. (2000), Life technology introduces revolutionary GibcoBRL Gateway cloning technology, http://www.lifetech.com/gateway, ngày 20/02/2000
8. Aldemita, R. R. & Hodges, T. K. (1996), Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation of japonica and indica rice varieties, Heidelberg, ALLEMAGNE: Springer.
9. Andrian, S., Nigel, W. S. & Mark, R. F. (2003), Plant Biotechnology: The genetic manipulation of plants, Oxford University press.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
55
10. Bechtold, N. & Pelletier (1998), "In planta Agrobacterium mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plant by vaccum infiltration",
Methods Mol Biol, 82, pp. 259 - 266.
11. Bevan, M. (1984), "Binary Agrobacterium vectơs for plant transformation", Nucleic Acids Res, 12(22), pp. 8711-8721.
12. Bhattacharya, R. C., Viswakarma, N., Bhat, S. R., Kirti, P. B. & Chopra, V. L. (2002), "Development of insect-resistant transgenic cabbage plants expressing a synthetic cryIA(b) gene from Bacillus thuringiensis", Current Science, 83 (2), pp. 146-150.
13. Birch, R. G. (1997), PLANT TRANSFORMATION: "Problems and Strategies for Practical Application", Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48, pp. 297-326.
14. CloughS, J. & Bent, A. F. (1998), Floral dip: "A simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana", Plant J, 16(6), pp. 735-743.
15. Chang, C. & Meyerowitz, E. M. (1995), "The ethylene hormone response in Arabidopsis: a eukaryotic two-component signaling system", Proc Natl Acad Sci U S A, 92(10), pp. 4129-4133.
16. Cheng, C. & Shuman, S. (2000), "Recombinogenic flap ligation pathway for intrinsic repair of topoisomerase IB-induced double-strand breaks", Mol Cell Biol, 20(21), pp. 8059-8068.
17. Cheng, M. H., Yao, Y. M., Yao, S., Liang, H. P., Li, H. Y., Dong, N., Yu, Y. & Sheng, Z. Y. (2004), "Effects of extracellular signal-regulated kinase inhibition by AG126 on tissue tumor necrosis factor-alpha expression and multiple organ dysfunction in rats with postburn Staphylococcus aureus sepsis", Zhonghua Wai Ke Za Zhi , 42(7), pp. 391-395.
18. Chu, C. C., Wang, C. C., S., S. C., Hsu, C., Yin, K. C., Chu, C. Y. & Bi, F. Y. (1975), "Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen source, Sci Sin, 18, pp. 659 - 668.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
19. Chumakov, M. I., Rozhok, N. A., Velikov, V. A., Tyrnov, V. S. & Volokhina, I. V. (2006), "In planta transformation of maize through inoculation of Agrobacterium into the silks", Genetika, 42(8), pp. 1083- 1088.
20. Dean, D. H. (1984), "Biochemical genetics of the bacterial insect-control agent Bacillus thuringiensis: basic principles and prospects for genetic engineering", Biotechnol Genet Eng Rev, 2, pp. 341-363.
21. Desfeux, C., Clough, S. J. & Bent, A. F. (2000), "Female reproductive tissues are the primary target of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method", Plant Physiol, 123(3), pp. 895-904. 22. Dingman, D. W. & Stahly, D. P. (1984), "Protection of Bacillus larvae
from Oxygen Toxicity with Emphasis on the Role of Catalase", Appl Environ Microbiol, 47(6), pp. 1228-1237.
23. Dubin, M., Bowler, C. & Benvenuto, G. (2008), "A modified Gateway cloning strategy for overexpressing tagged proteins in plants", Plant Methods, 4(1), pp. 3.
24. Earley, K. W., Haag, J. R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K. & Pikaard, C. S. (2006), "Gateway-compatible vectơs for plant functional genomics and proteomics", Plant J , 45(4), pp. 616-629.
25. Enriquez-Obregon, G. A., Vazquez-Padron, R. L., Prieto-Samsonov, D. L. & De La Riva, G. A. (1998), Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrobacterium-mediated transformation,
Heidelberg, ALLEMAGNE: Springer.
26. Ernst, H. C., Beebe, W. L., Moore, V. A., Van Es, L. & Arms, B. L. (1911), "Report of the Committee on Standard Methods for the Bacterial Diagnosis of Glanders",. J Am Public Health Assoc, 1(7), pp. 493-502.
27. Fang, S., Wang, L., Guo, W., Zhang, X., Peng, D., Luo, C., Yu, Z. & Sun, M. (2009), "Bacillus thuringiensis bel protein enhances the toxicity of
cryIA(c) protein to Helicoverpa armigera larvae by degrading insect intestinal mucin", Appl Environ Microbiol , 75 (16), pp. 5237-5243.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
57
28. Fiona, R. H., Andrew, M., Kirstine, M. & Fiona, J. W. (2003), "One step analysis of seed storage data and the longevity of Arabidopsis thaliana