3. Nội dung nghiên cứu
1.4.1. Công nghệ Gateway
Công nghệ Gateway là công nghệ được tạo nên từ việc kết hợp kiến thức thuộc các lĩnh vực của công nghệ sinh học như: kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử.... Công nghệ này cho phép điều khiển chức năng gen, biểu hiện protein và nhân dòng một đoạn trình tự ADN một cách nhanh và chính xác. Để đạt được điều này, cần gắn gen quan tâm vào vị trí Gateway của vectơ nhận, sau đó có thể gắn lên tất cả các loại vectơ biểu hiện hay vectơ chuyển gen mong muốn. Sự tiện lợi của hệ thống có được là do sự có mặt của trình tự tái tổ hợp att và khả năng xúc tác cho phản ứng tái tổ hợp của enzym clonase [7].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
Hình 1.4. Tổng quan về phƣơng pháp Gateway [7].
Trên cùng là gen được quan tâm, 3 thẻ màu vàng chỉ ra nguồn có thể thu nhận gen. Một khi gen quan tâm đã được gắn vào 1 vectơ nhận, nó sẵn sàng biểu hiện trong một số vectơ khác. Mũi tên hai chiều màu vàng chỉ rằng các
vectơ này có thể được tái cấu trúc lại tạo nên các vectơ nhận mới.
Công nghệ Gateway tốt hơn các phương pháp khác bởi vì chúng được cải tiến dựa trên các phương pháp nhân dòng khác như sử dụng enzym giới hạn, PCR với mồi đặc hiệu và một vài phương pháp khác. Công nghệ này có ưu điểm là nhanh, không cần thực hiện qua đêm [24]. Hệ thống Gateway chỉ cần nuôi 1 giờ trước khi chuyển sang môi trường chọn lọc. Gen quan tâm có thể biểu hiện dễ dàng trong hệ thống vectơ bởi vùng tái tổ hợp Gateway. Công nghệ này cho hiệu quả gắn gen chính xác với tỷ lệ thành công cao hơn 90% [7]. Tỷ lệ thành công cao này có được vì gen ccdB ngăn chặn sự phát triển của phage trong môi trường như thể sử dụng 2 loại kháng sinh trong môi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18
trường nuôi cấy. Tất cả các loại trình tự ADN đều có thể được nhân dòng, như sản phẩm PCR, cADN, hoặc hệ gen [7]. Gateway được chấp nhận ở một số loài sinh vật như động vật có vú, côn trùng, E. Coli ... [16].
Cách hoạt động của hệ thống Gateway
Bước đầu tiên trong công nghệ Gateway là gắn gen quan tâm vào vị trí Gateway trên vectơ nhận. Vectơ này là một plasmid có chứa vị trí gắn gen quan tâm và 2 trật tự biên attL. Thông thường để gắn gen lên vectơ nhận này có 4 phương pháp. Đầu tiên là phương pháp sử dụng enzym cắt giới hạn và enzym ligase. Cách thứ hai là tạo sản phẩm PCR với phần đuôi cộng thêm 4 nucleotid GGTA vào đầu 3’. Sản phẩm PCR này sẽ được gắn vào vectơ nhận sử dụng phản ứng BP. Còn 2 cách khác được áp dụng với đoạn ADN đã được gắn sãn trên một vectơ nhân dòng hoặc trên một vectơ biểu hiện [7].
Ngày nay vectơ nhận được thiết kế cho việc nhận gen trở lên dễ dàng hơn. Điều đó có được là vì với phage lambda bạn có thể dễ dàng nhân gen quan tâm, sử dụng phản ứng LR, hoặc tạo nên một vectơ mới từ những vectơ nhân dòng đã có sử dụng phản ứng BP [7].
Ở đây, những vị trí attL, attR, attB và attP là những chìa khóa quyết định sự thành công của công nghệ Gateway. Chúng là vị trí nhận biết của enzym giới hạn, nằm ở hai bên của gen quan tâm, cần thiết cho hệ thống Gateway bởi vì vùng attL được cắt tạo đầu dính bởi 1 loại protein của hệ thống Gateway. Đầu dính này sẽ bắt cặp với đầu dính trên vectơ đích có chứa trình tự attR để tạo nên vectơ mới. Quá trình gắn này được gọi là phản ứng LR. Vectơ mới tạo ra có chứa một phần vị trí cắt của attL và attR. Trình tự mới này được gọi là trình tự attB trong vectơ biểu hiện và attP trong sản phẩm. Điều này rất quan trong bởi vì hệ thống Gateway cho phép trao đổi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
ngược tất cả gen, nghĩa là chúng ta có thể tạo nhiều vectơ hơn từ vectơ biểu hiện đó trong phản ứng BP. Về bản chất quá trình tái tổ hợp trình tự attB và
attP cũng tương tự như quá trình xảy ra với attL và attR [7].
Một phản ứng LR đòi hỏi một vectơ nhận, một vectơ đích và hỗn hợp enzym LR clonase. Hỗn hợp này bao gồm protein tái tổ hợp cần thiết cho quá trình cắt và định hướng chuyển đoạn cắt lên vectơ biểu hiện. Tất cả những việc phải làm với phản ứng là giữ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 1 giờ, sau đó biến nạp vào tế bào E. coli và kiểm tra kết quả [7].
Hình 1.5. Sơ đồ minh họa cho phản ứng LR [7].
A) Trước khi phản ứng sảy ra, B) Sau khi phản ứng sảy ra
Quá trình biểu hiện của gen rất rõ ràng và chính xác. Tỷ lệ khuẩn lạc mang gen quan tâm sống sót cao là do trong quá trình tái tổ hợp có sự tham gia của gen kháng kháng sinh và một gen thông minh được gọi là ccdB. Phản ứng LR tạo ra 4 sản phẩm, trong đó chỉ có một sản phẩm đúng và phát triển trong môi trường chọn lọc, còn 3 sản phẩm khác bao gồm sản phẩm phụ và vectơ đích có chứa gen ccdB sẽ bị chết trên môi trường chọn lọc [7].
A)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
1.4.2. Vectơ nhân dòng pENTRTMD/TOPO cloning
Vectơ pENTRTMD/TOPO cloning là một vectơ tách dòng hiệu quả cao thuộc hệ thống vectơ Gateway, vectơ này có đặc điểm chỉ cần 5 phút để gắn 1 sản phẩm phản ứng PCR đầu bằng vào vectơ tách dòng này. Sản phẩm PCR không cần xử lý bằng enzym giới hạn, không cần sử dụng enzym ligase, mà vẫn có tỷ lệ gắn đúng lớn hơn 90%. Một lý do để vectơ pENTR được lựa chọn làm vectơ tách dòng bởi vì nó giúp chuyển nguyên vẹn đoạn ADN được nhân dòng sang vectơ biểu hiện, điều đó giúp cho quá trình biểu hiện của gen trong vectơ, đơn giản và thuận lợi hơn [36].
Vectơ pENTR được tạo lên dựa trên những trình tự đặc biệt của vi khuẩn lambda [44], những trình tự này cho phép chuyển nhanh và chính xác một đoạn ADN quan tâm vào vectơ đích. Để biểu hiện một gen quan tâm bằng công nghệ Gateway, trong đó vectơ nhận là pENTR thông thường gồm một số bước sau:
1. Gắn gen quan tâm vào vectơ pENTR để tạo ra vectơ nhận.
2. Thực hiện phản ứng LR giữa vectơ nhận và vectơ biểu hiện được lựa chọn để chuyển gen quan tâm lên vectơ biểu hiện.
3. Biểu hiện cấu trúc gen quan tâm trong vật chủ thích hợp (ví dụ: động vật, nấm men, côn trùng hày vi khuẩn ...) và phân tích protein được tổng hợp.
Đặc điểm của vectơ pENTRTM
TOPO
Vectơ pENTRTM
/D-TOPO được dùng để nhân dòng nhanh và chính xác các sản phẩm PCR đầu bằng và làm vectơ nhận của hệ thống Gateway. Vectơ này có đặc điểm:
+ Trình tự attL1 và attL2 là trình tự tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực khuẩn thể lambda, trình tự này cho phép chuyển vùng gen quan tâm đã được gắn vào vectơ nhận lên vectơ đích [44].
+ Trình tự T7 promoter/priming site cho phép dịch mã trong phòng thí nghiệm và xác định trình tự đoạn xen.
+ Vị trí nhân dòng TOPO cho phép gắn nhanh và chính xác một gen lên vectơ nhân dòng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21
+ Vectơ đích có chứa trình tự kết thúc phiên mã rrnB, trình tự này giúp ngăn chặn quá trình biểu hiện ra sản phẩm của gen trong vi khuẩn E. coli.
+ Vectơ nhận và vectơ biểu hiện có chứa gen kháng kanamycin, cho phép sàng lọc các chủng khuẩn chứa gen quan tâm trong vi khuẩn E. coli.
+ Trong vectơ nhận và vectơ biểu hiện có chứa vùng khởi đầu sao chép pUC, cho phép tạo nhiều bản sao của plasmid và bảo vệ plasmid trong E. coli.
Hoạt động của enzym Topoisomerase I trong vectơ nhận
Topoisomerase I được tách từ virus Vaccinia, chúng có đặc điểm: có 1 vị trí ADN mạch kép đặc biệt (CCCTT), và liên kết phosphodieste trên một mạch của vị trí này bị đứt gãy [55]. Năng lượng từ sự đứt gãy này được sử dụng để xây dựng một liên kết cộng hóa trị giữa đầu 3’ phosphate của mạch đơn với phần tyrosyl còn lại của topoisomerase I. Liên kết photpho -tyrosyl giữa ADN và enzyme có thể bị phá bỏ bởi đầu 5’ hydroxyl của sơi gốc. Sự đảo chiều của phản ứng và ngắt mạch được thực hiện dưới tác dụng của enzym topoisomerase [55]. Lợi dụng đặc điểm này chúng ta có thể nhân dòng sản phẩm PCR đầu bằng được tốt hơn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
22
Định hƣớng nhân dòng của vùng TOPO trong nhân dòng
Để gắn đoạn ADN mạch kép vào vị trí TOPO của vectơ nhận nhà sản xuất gắn thêm một trình tự mạch đơn vào đầu 3’ [16]. Trình tự mạch đơn này giống hệt với trình tự ADN đầu 5’ của vùng TOPO. Ý tưởng này được Invitrogent sử dụng và thiết lập lại bằng cách bổ xung 1 đoạn trình tự mở gồm 4 nucleotid (GTGG) vào vùng TOPO và gắn vào hầu hết các vectơ. Theo đó, để chèn gen quan tâm vào các vectơ nhận đó, người ta bổ sung 4 trình tự (CACC) vào mồi xuôi của phản ứng PCR. Sau đó sản phẩm tạo ra có đầu 5’ bổ sung với đầu 3’ trên vectơ tách dòng, nhờ chức năng gắn các bazơ của vùng TOPO sẽ làm cho sản phẩm PCR được ổn định trong vectơ nhận. Theo công nghệ này, đoạn ADN cần nhân có thể được nhân dòng rất nhanh với độ chính xác lên tới trên 90% [40].
Tối ƣu hóa phản ứng nhân dòng
Trong phản ứng gắn ADN lên vectơ nhận, tỷ lệ sản phẩm PCR/vectơ TOPO từ 0,5/1 đến 2/1 sẽ cho tỷ lệ gắn gen lên vectơ nhân dòng cao. Với những trường hợp sản phẩm phản ứng PCR có kích thước lớn hơn 1kb hoặc ít thì có thể kéo dài thời gian phản ứng để tăng tỷ lệ này [36].
1.4.3. Vectơ chuyển gen pB2GW7
Vectơ pB2GW7 là vectơ nhân tạo dùng để chuyển gen vào thực vật, vectơ này có kích thước là 10,882 kb có đặc điểm như sau:
Hình 1.7. Sơ đồ vectơ pB2GW7 [36]
+ Có promoter 35S và terminator 35S cho phép khởi đầu và kết thúc quá trình phiên mã của gen được gắn vào.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23
+ Có trình tự LB và RB là trình tự biên trái và biên phải của vùng T- ADN, vùng này gồm 25 bp có cấu trúc lặp lại không hoàn toàn, có chức năng giúp cho quá trình chuyển T-DNA sang tế bào thực vật.
+ Có chứa gen bar, gen kháng thuốc trừ cỏ gốc phosphonothricin (PPT), chức năng để chọn lọc thực vật chuyển gen.
+ Trình tự attR1 và attR2 là trình tự tái tổ hợp có nguồn gốc từ thực khuẩn thể lambda, có chức năng tạo vị trí tiếp nhận gen được chuyển sang từ vectơ nhận trong phản ứng LR.
+ Có chứa gen ccdB là một gen thông minh, gen này gây chết các tế bào chứa nó trong môi trường có kháng sinh kanamycin
1.5. Vi khuẩn B. thuringiensis và gen cry
1.5.1. Những nghiên cứu chung về B. thuringiensis
Bacillus thuringiensis (B. thuringiensis) là một loại vi khuẩn đất được tìm thấy tại Nhật Bản vào năm 1901 [38] và ở Đức vào năm 1911 [26]. Sau đó chúng được tìm thấy ở nhiều nơi khác như đất rừng, cát bụi, phân rơi, nước biển, xác côn trùng. Đây là loài vi khuẩn hiếu khí hình que, gram dương, có khả năng hình thành bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi [47]. Vi khuẩn này sản xuất ra các protein tinh khiết rất độc đối với ấu trùng của nhiều loài côn trùng nhưng không độc với động vật có xương sống (động vật có vú, chim, cá ...) [20]. Vi khuẩn này có thể sản sinh ra bốn loại độc tố hại côn trùng khác nhau: ngoại độc tố α, β, γ toxin và nội độc tố δ toxin. Trong đó nội độc tố δ toxin là quan trọng nhất. Tinh thể protein do vi khuẩn này tạo ra sau khi xâm nhập vào côn trùng sẽ bị các protease trong ruột côn trùng phân giải thành các đoạn nhỏ trong đó có đoạn mang khối lượng phân tử là 68.000 dalton chứa gần 1200 aminoaxit có hoạt tính độc gây hỏng ruột côn trùng. Năm 1984, Stahly đã tách được gen mã hóa protein này (Bt toxin) [22]. Các gen này thường định vị trên plasmid của vi khuẩn và gọi tên chung là gen ICP
(Insecticidal Crystal protein) [22]. Do vi khuẩn B. thuringiensis là vi khuẩn phức tạp có hơn 30 serotype nên chúng có chứa các gen ICP khác nhau và tạo nên những nhóm độc tố khác nhau [22].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
Do vi khuẩn này có khả năng diệt côn trùng tốt, nên đến từ những năm 1970 vi khuẩn này đã đươc nghiên cứu tạo ra chế phẩm để diệt sâu và được gọi là chế phẩm Bt. Chế phẩm này được dùng để diệt nhiều loại sâu hại khác nhau như bộ cánh cứng, bộ hai cánh, bộ cánh vẩy, bộ cánh màng ... với hiệu lực khá mạnh [20]. Mặc dù được coi là thuốc trừ sâu hiệu quả cao và an toàn, nhưng nó cũng có một số hạn chế nhất định về phương diện sinh học như thời gian ảnh hưởng ngắn hiệu quả tác động chậm, không tiếp xúc được với côn trùng ẩn sâu dưới lá, đất. Điều đó đã phần nào làm giảm mức độ sử dụng của chế phẩm này. Những nhược điểm này hoàn toàn bị loại trừ khi người ta chuyển gen cry vào cây trồng để tạo cây trồng kháng sâu [22]. Tiếp đó, từ năm 1996 đến nay có rất nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng sâu được tạo ra như: lúa, ngô, đậu tương, bông, ... [39].
1.5.2. Những nghiên cứu về gen cry
Năm 1982, Held đã đề nghị sử dụng chữ viết tắt “cry” (Crystal) để chỉ các gen tạo tinh thể độc tố của B. thuringiensis. Dựa trên tác động chuyên biệt và sự tương đồng về trình tự, gen tạo protein độc tố có thể được chia làm sáu nhóm chính và được ký hiệu từ cryI đến cryVI. Trong mỗi nhóm lại có các nhóm phụ được ký hiệu theo chữ cái từ A đến G [20].
Gen cryI mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước từ 130 - 140 kDa gây hại cho sâu bộ cánh vẩy (Lepidoptera), điển hình như loài sâu quấn lá, sâu đo, sâu róm, sâu đục gân lá ...
Gen cryII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 66 kDa gây hại cho sâu bộ cánh vẩy và bộ hai cánh (Diptera), điển hình như ruồi đục quả.
Gen cryIII mã hóa cho loại tiền độc tố có kích thước 73 kDa gây độc tính lên ấu trùng bộ cánh cứng Coleoptera, gồm các loại sâu như câu cấu, xén tốc đục thân, bọ dừa ...
Gen cryIV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 72, 74, 128 và 135 kDa có tác dụng gây hại ấu trung bộ hai cánh.
Gen cryV mã hóa cho loại tiền độc tố có khối lượng 80 kDa có tác dụng gây hại ấu trùng bộ cánh vẩy và bộ cánh cứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
1.5.3. Những nghiên cứu về gen cryIA
Gen cryIA(c) là gen mã hóa cho protein gây độc cho côn trùng. Trong tự nhiên gen này có nguồn gốc từ vi khuẩn B. thuringiensis [20]. Gen này đã được các nhà khoa học phân lập, mang đi giải trình tự và chỉ ra rằng chúng có kích thước là 3,534 kb. Từ sau khi trình tự gen cryIA(c) được công bố trên ngân hàng gen có nhiều công trình nghiên cứu khác được thực hiện nhằm xây