2.2.1. Điều chế chitosan hòa tan trong nước (WSC)
Hiện nay có nhiều phương pháp để điều chế WSC. Với mục tiêu thu được WSC đạt hiệu suất cao, các thiết bị sử dụng đơn giản dễ dàng áp dụng ở quy mơ phịng thí nghiệm, chúng tơi sử dụng phương pháp hóa học với tác nhân chính là H2O2 để phân cắt mạch chitosan. Quy trình tổng hợp được thực hiện như sau:
Đầu tiên cân 1gam chitosan cho vào cốc thủy tinh. Cho 20ml dung dịch axit axetic 2%, khuấy đều để hòa tan chitosan. Dung dịch H2O2 (4-6%) được thêm vào cốc, sau đó được khuấy trên máy khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-60ºC. Sau khi thực hiện xong phản ứng, dung dịch được trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% đến pH 7. Phần chitosan không tan trong nước sẽ nổi lên trên, lọc bỏ phần nổi lên, thu phần dịch lọc. Tiếp theo, thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối vào dịch lọc, sấy qua đêm ở 50ºC. Phần WSC sau khi đem sấy sẽ nổi lên trên. Lọc lại một lần nữa, thu phần kết tủa, sấy khô ở nhiệt độ phòng thu được WSC.
Hiệu suất tạo WSC: H = ố ố
29 Hình 2.1: Quy trình điều chế WSC
2.2.2. Tối ưu hóa q trình điều chế chitosan hịa tan trong nước(WSC)
Sau khi tổng hợp WSC, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng WSC tạo ra như nồng độ H2O2, thời gian khuấy và nhiệt độ của phản ứng [10].
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2
Quá trình điều chế WSC được tiến hành như trên (mục 2.2.1) với những nồng độ H2O2 khác nhau ( 6%; 5,5%; 5%; 4,5%; 4% ). Phản ứng được tiến hành ở 300C trong vòng 2 giờ.
1.Trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% 2. Lọc bỏ kết tủa
3. Thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối
1. Sấy qua đêm ở 50ºC
2. Lọc lấy kết tủa, sấy ở nhiệt độ phòng
chitosan
Hòa tan chitosan
Chitosan được phân cắt mạch
WSC
1. Dung dịch CH3COOH 2% 2. Khuấy
1. Dung dịch H2O2 (4-6%)
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
Dung dịch chứa chitosan hòa tan
30
2.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy
Quá trình điều chế WSC được tiến hành như trên (mục 2.2.1) với thời gian khuấy khác nhau ( 2 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ ). Phản ứng được tiến hành với nồng độ H2O2 5,5% ở 30ºC.
2.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Quá trình điều chế WSC được tiến hành như trên (mục 2.2.1) với những nhiệt độ khác nhau ( 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC). Phản ứng được tiến hành với nồng độ H2O2 5,5% trong vòng 3,5 giờ.
2.2.2. Tổng hợp gel trị bỏng (WSC/nano bạc/ curcumin)
Cân 1,293 gam bột tinh nghệ (chứa 25% curcumin) hòa tan vào 1ml cồn tuyệt đối, khuấy trộn đều tạo hồn hợp lỏng sệt.
Thêm 2,055 gam WSC vào hỗn hợp trên, thêm vào 3ml dung dịch nano bạc, khuấy trộn đều tạo hỗn hợp đồng nhất. Bảo quản gel trong tủ lạnh.
Hình 2.2: Quy trình tổng hợp gel trị bỏng 2.2.3. Phân tích đặc trưng của vật liệu 2.2.3. Phân tích đặc trưng của vật liệu
Phân tích cấu trúc của WSC
Cấu trúc của WSC được tạo ra từ chitosan được xác định bằng phương pháp phổ hồng ngoại (IR) trong vùng từ 400 4.000 cm-1. Vùng này sẽ cho ta những thông
Bột tinh nghệ
Hổn hợp lỏng sệt
Gel trị bỏng
(WSC-nano bạc- curcumin)
1. Dung dịch cồn tuyệt đối 2. Khuấy trộn
1. WSC
2. dung dịch nano bạc 3. Khuấy trộn
31
tin quan trọng về dao động của các phân tử từ đó là thơng tin về cấu trúc của phân tử. Từ kết quả ta sẽ xác định được sơ bộ các nhóm chức trong WSC và đưa ra nhận xét.
Phân tích đặc trưng của gel và thành phần có trong gel
Đặc trưng của gel là mịn màng, dễ bám dính, dễ rửa. Sau khi bơi gel lên bề mặt vết bỏng sẽ tạo lớp màng tránh sự xâm nhập của vi khuẩn gây viêm nhiễm.
Trong thành phần của gel, ion bạc sẽ đóng vai trị diệt khuẩn. Hầu hết ion bạc được gắn với protein mô và các ion bạc tự do được phóng thích dần dần với nồng độ đủ độc cho vi khuẩn. Bên cạnh đó, WSC có tác dụng làm mềm mơ cháy cứng, làm lớp mô chết tự tiêu hủy và bong tróc giúp vết bỏng mau lên da non và lành vết thương nhanh chóng hơn. Ngồi hai thành phần nano bạc và WSC, hoạt chất curcumin được sử dụng để làm vết thương mau liền sẹo.
Khả năng điều trị bỏng của gel trị được chứng minh rõ hơn khi thí nghiệm trên thỏ.
Thỏ được cạo lơng sau đó tạo ra 4 vết bỏng với mức độ bỏng như nhau trên cùng một con thỏ.
+ Vết thứ 1: Không sử dụng bất kỳ loại thuốc nào, để vết bỏng lành tự nhiên + Vết thứ 2: Sử dụng gel WSC được hịa tan trong nước bơi lên vết thương bỏng
+ Vết thứ 3: Sử dụng gel WSC- nano bạc bôi lên vết thương bỏng
+ Vết thứ 4: Sử dụng gel WSC- nano bạc- curcumin bôi lên vết thương bỏng Thực hiện bôi loại gel khác nhau lên từng bề mặt bị bỏng theo trình tự đã được sắp xếp, quan sát quá trình hổi phục và rút ra kết luận.
32
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều chế WSC
3.1.1. WSC được điều chế
WSC được điều chế từ chitosan theo quy trình ở trên (mục 2.2.1), kết quả của quá trình được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: (a) WSC được điều chế ở dạng rắn; (b) WSC được hòa tan trong
nước
WSC sau khi được điều chế [hình 3.1 (a)] được hịa tan vào dung dịch nước cất. Sau một thời gian khuấy, WSC đã tan hoàn toàn trong nước tạo dung dịch trong suốt [hình 3.1 (b)].
3.1.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Sau khi thực hiện q trình điều chế WSC, chúng tơi tiến hành phân tích cấu trúc bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại của chitosan, WSC điều chế. Để làm rõ hơn về sự giống và khác nhau giữa các chất, chúng tôi so sánh phổ của chitosan, WSC điều chế và WSC thương mại rồi rút ra kết luận.
33
Hình 3.2: Phổ IR của chitosan
Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy. Trên phổ đồ xuất hiện các pic tại
3440,32 cm-1 đặc trựng cho nhóm OH. Bên cạnh đó, cịn có các dao động ở 2919,28 cm-1 của liên kết (-CH2); ở 1653,14 cm-1 của liên kết (N-H); ở 1081,4 cm-1 của liên kết (C=O).
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) của WSC điều chế
34
Kết quả đo phổ hồng ngoại của WSC điều chế được trình bày ở hình 3.3. Nhìn vào phổ đồ, các pic của các nhóm chức và liên kết tương tự như phổ đồ của chitosan (hình 3.2) như ở 3416,91 cm-1 đặc trưng cho nhóm OH; ở 2923,53 cm-1 là liên kết (-CH2); ở 1637,81 cm-1 liên kết (N-H); ở 1081,68 cm-1 liên kết (C=O).
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại của chitosan, WSC điều chế, WSC thương mại
Hình 3.4: Phổ IR của chitosan(1), WSC điều chế(2), WSC thương mại(3)
Kết quả đo phổ hồng ngoại của chitosan(1), WSC được điều chế(2), WSC thương mại (3) được trình bày ở hình 3.4. Khi so sánh phổ, ta thấy rằng trên cả ba phổ đồ đều xuất hiện pic mang nhóm chức đặc trưng của chitosan như nhóm OH, các dao động của liên kết (C=O), liên kết(N-H), liên kết (-CH2).
Vậy khi thực hiện quá trình cắt mạch chitosan để tạo WSC chỉ làm thay đổi khối lượng phân tử của chitosan mà không làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc đặc trưng của chitosan.
3.2. Tối ưu hóa q trình điều chế WSC
Để tạo WSC, một trong những yếu tố quan trọng đầu tiên phải nói đến là nồng độ H2O2, thời gian khuấy cũng như nhiệt độ phản ứng thích hợp sẽ tạo môi trường thuận lợi để điều chế WSC với hiệu quả cao nhất.
35
Để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh hưởng, chúng tôi tiến hành quá trình điều chế như sơ đồ trong hình 2.2. Với khoảng nồng độ H2O2 4 -6%, thời gian của phản ứng được duy trì từ 2-4 giờ, nhiêt độ được khảo sát 40-60ºC.
Các kết quả thu được sẽ được ghi thành bảng để đánh giá và cuối cùng rút ra kết luận các giá trị mà tại đó lượng WSC thu được là cao nhất.
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2O2 lên quá trình điều chế WSC
Hình 3.5: WSC được điều chế trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ
H2O2 theo nồng độ lần lượt (4%; 4,5%; 5%; 5,5%; 6%)
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến quá trình điều chế WSC Nồng độ H2O2 (%) H (%) 4 15,8 4,5 21,1 5 12,4 5,5 31,9 6 22,8
36
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình điều chế
WSC
Kết quả thực nghiệm cho thấy tạo lượng WSC lớn nhất thì nồng độ H2O2 là 5,5% .Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn giá trị nồng độ H2O2 là 5,5% để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình điều chế WSC
Hình 3.7: WSC được điều chế trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng thời gian
khuấy lần lượt (2 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ)
8 13 18 23 28 33 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 H(%) Nồng độ H2O2 (%)
37
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian khuấyđến quá trình điều chế
Thời gian (giờ) H (%)
2 21,9
2,5 23,3
3 27,1
3,5 32,5
4 26,1
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian khuấyđến quá trình điều chế WSC
Nhìn vào đồ thị ta thấy thời gian tốt nhất của quá trình điều chế WSC là 4 giờ. Nên chúng tôi chọn thời gian là 4 giờ cho những thí nghiệm sau.
20,0 22,0 24,0 26,0 28,0 30,0 32,0 34,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 H%
38
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình điều chế WSC
Hình 3.9: WSC được điều chế trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ lần
lượt (30ºC; 40ºC; 50ºC; 60ºC)
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độđến quá trình điều chế WSC
Nhiệt độ (ºC) H (%)
30 31,9
40 79,1
50 63,5
39
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độđến quá trình điều chế WSC
Nhìn vào đồ thị, tại giá trị nhiệt độ là 40ºC, hiệu suất của quá trình điều chế WSC đạt cao nhất.
Như vậy điều kiện tối ưu để tổng hợp WSC sử dụng trong điều chế gel trị bỏng (WSC- nano bạc- curcumin) được xác định như sau: Nồng độ H2O2: 5,5%; thời gian khuấy: 3,5 giờ; nhiệt độ của phản ứng: 40ºC.
. 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 25 35 45 55 65 H (%) Nhiệt độ (ºC)
40
3.3. Điều chế gel trị bỏng
3.3.1. Gel trị bỏng (WSC-nano bạc-curcumin)
Hình 3.11: Gel trị bỏng (WSC- nano bạc- curcumin) sau khi được phối trộn
Gel trị bỏng khi tổng hợp theo quy trình ở trên (mục 2.2.2) có màu nâu vàng, hơi sệt. Khi bơi lên da tạo một lớp màng bám dính. Sau khi được tổng hợp, gel được giữ trong lọ kín, bảo quản trong tủ lạnh, tránh sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm mốc gây hỏng gel.
3.3.2. Quá trình hồi phục vết bỏng trên thỏ
Bắt đầu quá trình thực hiện làm bỏng và hồi phục của thỏ được thể hiện từ hình 3.12 đến hình 3.16.
Các vết thương (4) và được bôi với nh (1): Không bôi b
(2): Sử dụng gel WSC đư (3): Sử dụng gel WSC (4): Sử dụng gel WSC
41
Hình 3.12: Thỏ được cạo lơng
t thương có mức độ bỏng như nhau sẽ sắp xếp theo th i những loại gel khác nhau.
(1): Không bôi bất cứ loại gel nào, để vết thương hồi phụ ng gel WSC được hịa tan trong nước bơi lên vế ng gel WSC – nano bạc bôi lên vết thương
ng gel WSC – nano bạc- curcumin bơi lên vết thương
Hình 3.13: Vết bỏng trên thỏ ngày đầu tiên
p theo thứ tự (1), (2), (3), ục tự nhiên
ết thương
t thương
42
Sau 3 ngày, các vết bỏng chưa có chuyển biến rõ rệt.
Hình 3.14: Vết bỏng trên thỏ sau 3 ngày
Sau 6 ngày, vết bỏng thứ 4 có dấu hiệu hồi phục, lớp da chết bắt đầu mềm và bong tróc.
Hình 3.15: Vết bỏng trên thỏ sau 6 ngày
Sang ngày thứ 9, hầu hết các vết thương đều bong tróc dần để hình thành da non, riêng với vết bỏng thứ 1, lớp da cháy cứng có khá nhiều và dày.
43
Sau 12 ngày, vết thứ 1 lớp da chết còn khá nhiều, đối với vết thứ 2, 3, 4 đang trong quá trình hình thành da non và liền sẹo.
Hình 3.17: Vết bỏng trên thỏ sau 12 ngày
Sau 15 ngày quan sát quá trình hồi phục, thu được kết quả như sau:
Vết bỏng thứ 1: Sự bong tróc lớp da chết, hình thành da non trong 15 ngày chậm nhất so với những vết bỏng còn lại
Vết bỏng thứ 2: Quá trình hồi phục nhanh hơn so với vết bỏng thứ nhất, trong khoảng thời gian khảo sát, vết bỏng dần hồi phục, đã hình thành da non
Vết bỏng thứ 3: Khi sử dụng thêm nano bạc, tác dụng của gel WSC- nano bạc tốt hơn so với khi sử dụng gel chỉ có WSC, vết bỏng đang trong q trình liền sẹo
Vết bỏng thứ 4: Sử dụng gel WSC- nano bạc- curcumin mang lại hiệu quả cao nhất, vết bỏng gần như liền sẹo hoàn toàn
44
KẾT LUẬN
Qua thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu, chúng tôi đã đạt được một số kết quả như sau:
Đã điều chế WSC, khảo sát được các điều kiện tối ưu để tạo WSC với hiệu suất thu hồi cao.
- Nồng độ H2O2 của quá trình là 5,5%
- Thời gian khuấy trộn của phản ứng là 3,5 giờ - Nhiệt độ thích hợp của quá trình điều chế là 40ºC
Phối trộn gel trị bỏng
Một số nghiên cứu ghi nhận màng đắp vết thương bỏng có sự kết hợp của WSC và nano bạc giúp q trình điều trị vết thương trở nên nhanh chóng, mang lại hiệu quả cao.
Thử nghiệm trên thỏ kết quả mang lại khả quan.
Sau 15 ngày, đặc biệt với vết thứ 4 được bôi bởi gel WSC-nano bạc- curcumin cho hiệu quả điều trị cao nhất.
Khi so sánh với vết thương khơng hay có sử dụng một hay hai hoạt chất để điều trị vết bỏng, có thể thấy rằng việc sử dụng gel trị bỏng có sự kết hợp của WSC- nano bạc- curcumin mang lại hiệu quả cao nhất, chỉ sau thời gian 15 ngày, vết bỏng gần như hồi phục hoàn toàn.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tiếng Việt
[1] Nguyễn Thị Ngọc Trâm, “Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất oligochitosan
bằng phương pháp enzyme chitinase ”, Đồ án môn học công nghệ thực phẩm, Đại
học Nha Trang.
[2] Lê Phương Hà, “Nghiên cứu cải biến chitosan nhằm tăng cường hoạt tính
kháng khuẩn để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm ”, Luận văn thạc sĩ sinh học,
Đại học Tây Nguyên.
[3]Nguyễn Thị Thùy Trang,“ Nghiên cứu chitosan chiết tách từ vỏ tôm làm
tác nhân hấp phụ một số ion kim loại nặng trong môi trường nước”, Luận văn thạc
sĩ kỹ thuật, Đại học Đà Nẵng.
[4] Nguyễn Thụy Trà My, Nguyễn Thị Anh Thư, “Phương pháp thu nhận và
ứng dụng hợp chất Curcumin trong củ nghệ ”, báo cáo công nghệ tế bào, Đại học
Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh.
[5] Võ Thị Mai Hương, Trần Thị Kim Cúc,“ Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan oligosaccharide lên sinh trưởng và năng suất cấy lạc giống lạc L14”, Tạp
chí khoa học, Đại học Huế, tập 73, số 4, năm 2012.
[6] “ Nghiên cứu ứng dụng vật liệu chitosan trong y sinh và môi trường” từ
http://vast.ac.vn/index.php?option=com.
[7] “ Đại cương bỏng”, từ http://www.dieutri.vn/trieuchungngoai.
* Tiếng Anh
[8] Quiang Yu et al,“Preparation and Characterization of water-soluble
chitosan derivative by michael addition”, International Journal of Bilogical
Macromoecules 47(2010) 696-699.
[9] V.E Tikhonov et al Raed Al Zahrani,“Enzymic preparation of acid-free-
water-soluble chitosan”, Process Biochemistry 35 (2000) 563-568.
[10] Yujian Du et al,“Preparation of water-soluble chitosan from shrimp
shell and its antibacterial activity”, Innovative Food Science and Emerging
Technologies 10 (2009) 103-107.
[11] Zanariah Ujang et al,“The development characterization and application