a) Chitosan hòa tan trong nước:
WSC có tác dụng kháng khuẩn khá tốt đối với cả 3 loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm khuẩn bỏng cả invitro và invivo [10].
Ngoài ra WSC còn có tác dụng tăng cường tập trung các tế bào viêm vào vùng tổn thương trong giai đoạn sớm của quá trình liền vết thương, giúp vết thương được làm sạch nhanh chóng, tạo điều kiện tốt cho quá trình tái tạo. Vì vậy WSC được coi là dược chất quan trọng trong gel trị bỏng.
b) Nano bạc
Hình 1.12:Hình ảnh chụp TEM của nano bạc
Phương pháp điều chế nano bạc:
Một số phương pháp điển hình để chế tạo nano bạc sau:
- Phương pháp ăn mòn laze: đây là một phương pháp từ trên xuống. Vật liệu ban đầu là một tấm bạc được đặt trong một dung dịch có chứa chất hoạt động bề mặt. Một chùm Laser xung có bước sóng 532 nm, độ rộng xung là 10 ns, tấn số 10Hz, năng lượng mỗi xung là 90 mJ, đường kính vùng kim loại bị tác dụng từ 1- 3nm. Dưới tác dụng của chùm laser xung, các hạt nano có kích thước khoảng 10nm được hình thành và được bao phủ bới chất hoạt hóa bề mặt anion CnH2n+1SO3Na với n=8, 10, 12, 14 với nồng độ từ 0,001 đến 0,1M
- Phương pháp khử hóa học: dùng các tác nhân hóa học để khử ion kim loại thành kim loại. Thông thường, các tác nhân hóa học ở dạng dung dịch lỏng nên còn gọi là phương pháp hóa ướt. Đây là phương pháp từ dưới lên. Dung dịch ban đầu là AgNO3. Tác nhân khử thường được sử dụng là các chất hóa học như axit citric, vitamin C, NaBH4, etanol(cồn), eytlen glycol. Để các hạt nhân phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta sử dụng phương pháp tĩnh điện để
24
làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và đẩy nhau hoặc làm bền bằng chất hoạt hóa bề mặt. Bảo vệ bằng phương pháp tĩnh điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử. Phương pháp sử dụng chất hoạt động bề mặt hoặc hợp chất cao phân tử được sử dụng rộng rãi. Bằng phương pháp hóa học, người ta có thể chế tạo được các hạt nano có kích thước từ 10 đến 100 nm
- Phương pháp khử vật lý: dùng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng lượng cao như tia gamma, tia tử ngoại, tia laze để khử ion kim loại thành kim loại. Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý, có nhiều quá trình biến đổi của dung môi và phụ gia trong dung môi để sinh ra các hốc hóa học có tác dụng khử ion thành kim loại. Ví dụ, người ta dùng chùm laser xung có bước sóng 500nm, độ xung dài 6 ns, tần số 10 Hz, công suất 12-14 nJ chiều vào dung dịch có chứa AgNO3 như là gốc kim loại Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) như là chất hoạt hóa bề mặt để thu được hạt nano bạc
- Phương pháp khử sinh học: dùng vi khuẩn là tác nhân khử ion kim loại. Người ta cấy vi khuẩn MKY vào trong dung dịch có chứa ion bạc để thu được hạt nano bạc. Phương pháp này đơn giản, thân thiện với môi trường và có thể tạo hạt với số lượng lớn
Ứng dụng của nano bạc:
Nano bạc hiện nay được áp dụng rất nhiều trong các lĩnh vực của đời sống. Hầu như các ứng dụng này đều liên quan đến tính chất kháng khuẩn của nó.
- Trong các thiết bị gia dụng: điều hòa nhiệt độ, tủ lạnh, máy giặt, máy khử độc hoa quả…
- Trong sản xuất hàng tiêu dùng: bình sữa trẻ em, bát đĩa, đồ chơi, hộp đựng thực phẩm…
- Sản xuất sợi nhân tạo dùng dệt vải, khăn, quần áo, khẩu trang y tế… có khả năng kháng khuẩn, chống hôi.
- Y tế: tổng hợp các sản phẩm như bột bạc kháng khuẩn, các loại thuốc… hay các sản phẩm vô trùng tuyệt đối khi phủ lên bề mặt lớp nano bạc như băng gạc vệ sinh, dao kéo phẫu thuật…
Với hoạt tính kháng khuẩn, nano bạc trở thành hoạt chất quan trọng trong gel trị bỏng, mặt khác cũng là dung môi hòa tan WSC.
Cấu trúc hóa h
Curcumin là thành ph thuộc họ Gừng (Zingiberaceae
Hình 1.
Tên gọi: (1E,6E)-1,7-bis (4 Công thức phân tử: C21 Phân tử lượng: Mcurcumin
Tính chất vật lý:
- Curcumin trích t 185ºC
- Curcumin không tan trong nư dicloetylen, benzen, axit axetic
- Trong môi trư
acid, dung dịch có màu vàng ánh l tím trong môi trường ki
- Màu của curcumin b hiện diện của SO2 với n
- Dung dịch curcumin trong dung môi h sóng khoảng 420-430nm
25
u trúc hóa học:
là thành phần chính của curcuminoid – một ch Zingiberaceae) được sử dụng như một gia vị ph
Hình 1.13:Công thức cấu tạo của curcumin
bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) -1,6-heptadiene 21H20O6
curcumin= 368,38 g/mol
t lý:
Curcumin trích từ củ nghệ có dạng bột màu vàng, nhiệ
Curcumin không tan trong nước, tan trong cồn, axeton, met axit axetic…
Trong môi trường trung tính, dung dịch curcumin có màu vàng. Môi trư ch có màu vàng ánh lục (vàng chanh). Dung dịch có màu cam t
ng kiềm [4].
a curcumin bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có s i nồng độ ≥ 10ppm.
ch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp th 430nm. t chất trong củ nghệ phổ biến ở Ấn Độ [4]. a curcumin heptadiene-3,5-dione ệt độ nóng chảy 184- n, axeton, metanol, , ch curcumin có màu vàng. Môi trường ch có màu cam tới đỏ i ánh sáng và khi có sự p thụ cực đại ở bước
26
Hình 1.14: Hình ảnh curcumin trong tinh nghệ
Tính chất hóa học
- Curcumin dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng hoặc môi trường pH thích hợp
- Phản ứng cộng với hydro - Phản ứng tạo phức với kim loại
- Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzen - Phản ứng amin hóa
Ứng dụng của curcumin
- Curcumin có khả năng chống oxy hóa
- Curcumin được dùng trong điều trị HIV nhớ khả năng chống lại virus
- Curcumin có khả năng ngăn cản hoạt động của enzym cyclooxygenase tạo thêm tiểu huyết cầu nên curcumin có tác dụng chống đông máu
- Curcumin có hoạt tính kháng viêm và nhanh liền sẹo
Curcumin là hoạt chất cần thiết trong gel trị bỏng để làm nhanh tốc độ điều trị vết thương, chống viêm, mau liền sẹo.
NGUYÊN LI 2.1. Hóa chất, dụng c
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất đư không cần qua tinh chế
Danh sách các hóa ch Bảng 2.1 STT Tên hóa chất 1 Chitosan 2 Axit axetic 3 Hydro peoxit 4 Natri hidroxit 5 Etanol 6 Curcumin 7 Nano bạc 8 Nước cất 2.1.2. Dụng cụ Cốc thủy tinh 50ml Cốc thủy tinh100ml 27 CHƯƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ng cụ
t được sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại hóa ch ế lại.
Danh sách các hóa chất được sử dụng được thể hiện ở bả
ng 2.1: Danh sách các hóa chất sử dụng nghiên c
Công thức CH3COOH H2O2 NaOH C2H5OH H2O 50ml Đũa khuấy 100ml Nhiệt kế 100ºC
U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
i hóa chất tinh khiết, ảng 2.1 ng nghiên cứu Hãng sản xuất Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam
28
Ống đong 50ml Giấy đo pH Bình định mức 50ml Cân phân tích Bình định mức 100ml Giấy lọc Pipet 2ml Phễu lọc Pipet 5ml Phễu buchner Pipet 10ml Giấy nhôm Máy khuấy từ gia nhiệt Máy sấy
2.2 . Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Điều chế chitosan hòa tan trong nước (WSC)
Hiện nay có nhiều phương pháp để điều chế WSC. Với mục tiêu thu được WSC đạt hiệu suất cao, các thiết bị sử dụng đơn giản dễ dàng áp dụng ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp hóa học với tác nhân chính là H2O2 để phân cắt mạch chitosan. Quy trình tổng hợp được thực hiện như sau:
Đầu tiên cân 1gam chitosan cho vào cốc thủy tinh. Cho 20ml dung dịch axit axetic 2%, khuấy đều để hòa tan chitosan. Dung dịch H2O2 (4-6%) được thêm vào cốc, sau đó được khuấy trên máy khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-60ºC. Sau khi thực hiện xong phản ứng, dung dịch được trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% đến pH 7. Phần chitosan không tan trong nước sẽ nổi lên trên, lọc bỏ phần nổi lên, thu phần dịch lọc. Tiếp theo, thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối vào dịch lọc, sấy qua đêm ở 50ºC. Phần WSC sau khi đem sấy sẽ nổi lên trên. Lọc lại một lần nữa, thu phần kết tủa, sấy khô ở nhiệt độ phòng thu được WSC.
Hiệu suất tạo WSC: H = ố ố
29 Hình 2.1: Quy trình điều chế WSC
2.2.2. Tối ưu hóa quá trình điều chế chitosan hòa tan trong nước(WSC)
Sau khi tổng hợp WSC, chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến lượng WSC tạo ra như nồng độ H2O2, thời gian khuấy và nhiệt độ của phản ứng [10].
2.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2
Quá trình điều chế WSC được tiến hành như trên (mục 2.2.1) với những nồng độ H2O2 khác nhau ( 6%; 5,5%; 5%; 4,5%; 4% ). Phản ứng được tiến hành ở 300C trong vòng 2 giờ.
1.Trung hòa bằng dung dịch NaOH 10% 2. Lọc bỏ kết tủa
3. Thêm 2 phần thể tích cồn tuyệt đối
1. Sấy qua đêm ở 50ºC
2. Lọc lấy kết tủa, sấy ở nhiệt độ phòng
chitosan
Hòa tan chitosan
Chitosan được phân cắt mạch
WSC
1. Dung dịch CH3COOH 2% 2. Khuấy
1. Dung dịch H2O2 (4-6%)
2. Khuấy từ trong 2-4 giờ, ở 20-40ºC
Dung dịch chứa chitosan hòa tan
30
2.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy
Quá trình điều chế WSC được tiến hành như trên (mục 2.2.1) với thời gian khuấy khác nhau ( 2 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ ). Phản ứng được tiến hành với nồng độ H2O2 5,5% ở 30ºC.
2.2.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Quá trình điều chế WSC được tiến hành như trên (mục 2.2.1) với những nhiệt độ khác nhau ( 30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC). Phản ứng được tiến hành với nồng độ H2O2 5,5% trong vòng 3,5 giờ.
2.2.2. Tổng hợp gel trị bỏng (WSC/nano bạc/ curcumin)
Cân 1,293 gam bột tinh nghệ (chứa 25% curcumin) hòa tan vào 1ml cồn tuyệt đối, khuấy trộn đều tạo hồn hợp lỏng sệt.
Thêm 2,055 gam WSC vào hỗn hợp trên, thêm vào 3ml dung dịch nano bạc, khuấy trộn đều tạo hỗn hợp đồng nhất. Bảo quản gel trong tủ lạnh.
Hình 2.2: Quy trình tổng hợp gel trị bỏng
2.2.3. Phân tích đặc trưng của vật liệu
Phân tích cấu trúc của WSC
Cấu trúc của WSC được tạo ra từ chitosan được xác định bằng phương pháp phổ hồng ngoại (IR) trong vùng từ 400 4.000 cm-1. Vùng này sẽ cho ta những thông
Bột tinh nghệ
Hổn hợp lỏng sệt
Gel trị bỏng
(WSC-nano bạc- curcumin)
1. Dung dịch cồn tuyệt đối 2. Khuấy trộn
1. WSC
2. dung dịch nano bạc 3. Khuấy trộn
31
tin quan trọng về dao động của các phân tử từ đó là thông tin về cấu trúc của phân tử. Từ kết quả ta sẽ xác định được sơ bộ các nhóm chức trong WSC và đưa ra nhận xét.
Phân tích đặc trưng của gel và thành phần có trong gel
Đặc trưng của gel là mịn màng, dễ bám dính, dễ rửa. Sau khi bôi gel lên bề mặt vết bỏng sẽ tạo lớp màng tránh sự xâm nhập của vi khuẩn gây viêm nhiễm.
Trong thành phần của gel, ion bạc sẽ đóng vai trò diệt khuẩn. Hầu hết ion bạc được gắn với protein mô và các ion bạc tự do được phóng thích dần dần với nồng độ đủ độc cho vi khuẩn. Bên cạnh đó, WSC có tác dụng làm mềm mô cháy cứng, làm lớp mô chết tự tiêu hủy và bong tróc giúp vết bỏng mau lên da non và lành vết thương nhanh chóng hơn. Ngoài hai thành phần nano bạc và WSC, hoạt chất curcumin được sử dụng để làm vết thương mau liền sẹo.
Khả năng điều trị bỏng của gel trị được chứng minh rõ hơn khi thí nghiệm trên thỏ.
Thỏ được cạo lông sau đó tạo ra 4 vết bỏng với mức độ bỏng như nhau trên cùng một con thỏ.
+ Vết thứ 1: Không sử dụng bất kỳ loại thuốc nào, để vết bỏng lành tự nhiên + Vết thứ 2: Sử dụng gel WSC được hòa tan trong nước bôi lên vết thương bỏng
+ Vết thứ 3: Sử dụng gel WSC- nano bạc bôi lên vết thương bỏng
+ Vết thứ 4: Sử dụng gel WSC- nano bạc- curcumin bôi lên vết thương bỏng Thực hiện bôi loại gel khác nhau lên từng bề mặt bị bỏng theo trình tự đã được sắp xếp, quan sát quá trình hổi phục và rút ra kết luận.
32
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều chế WSC
3.1.1. WSC được điều chế
WSC được điều chế từ chitosan theo quy trình ở trên (mục 2.2.1), kết quả của quá trình được thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: (a) WSC được điều chế ở dạng rắn; (b) WSC được hòa tan trong nước
WSC sau khi được điều chế [hình 3.1 (a)] được hòa tan vào dung dịch nước cất. Sau một thời gian khuấy, WSC đã tan hoàn toàn trong nước tạo dung dịch trong suốt [hình 3.1 (b)].
3.1.2. Phổ hồng ngoại (IR)
Sau khi thực hiện quá trình điều chế WSC, chúng tôi tiến hành phân tích cấu trúc bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại của chitosan, WSC điều chế. Để làm rõ hơn về sự giống và khác nhau giữa các chất, chúng tôi so sánh phổ của chitosan, WSC điều chế và WSC thương mại rồi rút ra kết luận.
33
Hình 3.2: Phổ IR của chitosan
Kết quả thể hiện ở hình 3.2 cho thấy. Trên phổ đồ xuất hiện các pic tại
3440,32 cm-1 đặc trựng cho nhóm OH. Bên cạnh đó, còn có các dao động ở 2919,28 cm-1 của liên kết (-CH2); ở 1653,14 cm-1 của liên kết (N-H); ở 1081,4 cm-1 của liên kết (C=O).
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại (IR) của WSC điều chế
34
Kết quả đo phổ hồng ngoại của WSC điều chế được trình bày ở hình 3.3. Nhìn vào phổ đồ, các pic của các nhóm chức và liên kết tương tự như phổ đồ của chitosan (hình 3.2) như ở 3416,91 cm-1 đặc trưng cho nhóm OH; ở 2923,53 cm-1 là liên kết (-CH2); ở 1637,81 cm-1 liên kết (N-H); ở 1081,68 cm-1 liên kết (C=O).
3.1.2.1. Phổ hồng ngoại của chitosan, WSC điều chế, WSC thương mại
Hình 3.4: Phổ IR của chitosan(1), WSC điều chế(2), WSC thương mại(3)
Kết quả đo phổ hồng ngoại của chitosan(1), WSC được điều chế(2), WSC thương mại (3) được trình bày ở hình 3.4. Khi so sánh phổ, ta thấy rằng trên cả ba phổ đồ đều xuất hiện pic mang nhóm chức đặc trưng của chitosan như nhóm OH, các dao động của liên kết (C=O), liên kết(N-H), liên kết (-CH2).
Vậy khi thực hiện quá trình cắt mạch chitosan để tạo WSC chỉ làm thay đổi khối lượng phân tử của chitosan mà không làm ảnh hưởng nhiều đến cấu trúc đặc trưng của chitosan.
3.2. Tối ưu hóa quá trình điều chế WSC
Để tạo WSC, một trong những yếu tố quan trọng đầu tiên phải nói đến là nồng độ H2O2, thời gian khuấy cũng như nhiệt độ phản ứng thích hợp sẽ tạo môi trường thuận lợi để điều chế WSC với hiệu quả cao nhất.
35
Để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh hưởng, chúng tôi tiến hành quá trình điều chế như sơ đồ trong hình 2.2. Với khoảng nồng độ H2O2 4 -6%, thời gian của phản ứng được duy trì từ 2-4 giờ, nhiêt độ được khảo sát 40-60ºC.
Các kết quả thu được sẽ được ghi thành bảng để đánh giá và cuối cùng rút ra kết luận các giá trị mà tại đó lượng WSC thu được là cao nhất.
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H2O2 lên quá trình điều chế WSC
Hình 3.5: WSC được điều chế trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ H2O2 theo nồng độ lần lượt (4%; 4,5%; 5%; 5,5%; 6%)
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ H2O2 đến quá trình điều chế WSC
Nồng độ H2O2 (%) H (%) 4 15,8 4,5 21,1 5 12,4 5,5 31,9 6 22,8
36
Hình 3.6:Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình điều chế WSC
Kết quả thực nghiệm cho thấy tạo lượng WSC lớn nhất thì nồng độ H2O2 là 5,5% .Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn giá trị nồng độ H2O2 là 5,5% để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên quá trình điều chế WSC
Hình 3.7: WSC được điều chế trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng thời gian