CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phương pháp sắc kí cột
2.3.2.1. Khái niệm [32]
Cĩ thể nĩi sắc kí cột là một dạng của sắc kí giấy hoặc sắc kí lớp mỏng nhưng ở đây pha tỉnh được nhồi vào cột, pha động là chất lỏng được nạp liên tục, nhờ vậy cĩ thể triển khai một cách liên tục với nhiều hệ dung mơi khác nhau. Tùy theo tính chất của chất làm cột mà sự tách cĩ thể xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) ví dụ như silicagel, oxit nhơm hoặc cơ chế phân bố (cột phân bố) ví dụ như xenlulozơ.
Hình 2.5. Phương pháp sắc kí cột
2.3.2.2. Kỹ thuật sắc kí cột [31],[32]
a. Chọn chất hấp phụ
Lựa chọn chất hấp phụ phụ thuộc vào tính phân cực của mẫu cần phân tích. Thơng thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngồi ra cịn dùng Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
b. Lựa chọn dung mơi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung mơi hay hệ dung mơi chạy cột sắc kí silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng để tìm dung mơi phù hợp, với các bước cơ bản sau:
- Hồ tan hồn tồn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung mơi thích hợp. - Chuẩn bị 4 – 6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng nhỏ tương đương nhau.
giảm dần). Tiếp theo hiện hình dưới đèn UV hoặc thuốc hiện màu. Với đơn dung mơi sẽ dễ dàng thấy được dung mơi nào thích hợp. Từ kết quả đĩ tìm được hệ dung mơi (hai hay nhiều dung mơi) phù hợp để chạy cột sắc kí.
- Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của một phản ứng tổng hợp (2 – 3 chất) thì hệ dung mơi phù hợp là hệ cĩ thể đẩy chất cần quan tâm lên trên bản mỏng với Rf = 0,2 – 0,3.
- Sau khi chọn được hệ dung mơi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung mơi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ý:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
- Dung mơi ban đầu chạy cột là dung mơi phù hợp đã chọn được ở trên nhưng cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ như silicagel tráng trên bản mỏng cĩ kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
- Đối với sắc kí cột Sephadex LH 20 ta thường dùng một dung mơi là MeOH.
c. Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột
- Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với lượng silicagel sử dụng:
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 – 50 lần khối lượng của mẫu chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khĩ tách riêng thì tỉ lệ này cịn cao hơn (khoảng 100 – 200 lần).
d. Tỉ lệ giữa chiều cao lượng silicagel và đường kính trong của cột sắc kí
- Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng 10 : 1.
- Muốn biết lượng silicagel cĩ phù hợp với cột hay khơng thì cho silicagel khơ (chưa cĩ dung mơi) vào cột để quan sát.
e. Cách nạp silicagel vào cột
Để việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột theo hai cách:
- Nạp silicagel ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột khơng cĩ lớp thuỷ tinh xốp thì ta cho một lớp bơng thủy tinh mỏng vào đáy để ngăn khơng cho silicagel chảy xuống bình hứng. Cho lượng silicagel vào cột cho đến khi đạt lượng mong muốn, đổ silicagel vào bình đựng (cốc). Cho hệ dung mơi chạy cột ban đầu vào bình đựng và khuấy đều.
Lưu ý:
+ Lượng dung mơi phải vừa đủ để hỗn hợp khơng được quá sệt khiến bọt khí sẽ bị giữ trong cột và cũng khơng được quá lỏng.
+ Rĩt hỗn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc (vừa rĩt vừa khuấy đều) và mở nhẹ khố để dung mơi chảy xuống bình hứng (dung mơi này tiếp tục được dùng để rĩt trở lại đầu cột).
+ Tiếp tục rĩt hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rĩt vừa gõ nhẹ thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong cho dung mơi chảy đều qua cột hai đến ba lần để cột được đồng nhất.
Lưu ý:
+ Nhất thiết khơng để đầu cột bị khơ, nghĩa là luơn luơn cĩ dung mơi phủ trên phần đầu cột.
+ Sau khi nạp cột xong, mặt thống silicagel phải phẳng. Nếu mặt thống chưa phẳng ta cĩ thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung mơi sát mặt thống làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ từ tạo nên mặt thống bằng phẳng.
+ Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm sephadex với dung mơi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho vào cột.
- Nạp silicagel dạng khơ
+ Nếu mẫu chất khơng tan trong dung mơi đã chọn thay vì phải hịa tan mẫu trong dung mơi phân cực (cĩ thể ảnh hưởng đến quá trình giải ly) thì cĩ thể nạp mẫu khơ.
cột khơng cĩ lớp thủy tinh xốp), rĩt dung mơi chạy cột ban đầu vào khoảng hai phần ba cột. Cho từ từ silicagel dạng khơ vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Sau khi nạp silicagel xong, cho dung mơi chảy qua vài lần, kết hợp dùng máy nén (hoặc gõ nhẹ cột) cho đến khi đuổi hết bọt khí trong cột, để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào.
Thơng thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
f. Cách nạp mẫu vào cột
Cĩ hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khơ và phương pháp ướt.
- Phương pháp nạp mẫu khơ:
Mẫu được nạp ở dạng khơ. Thường áp dụng cho trường hợp mẫu chất nhiều, khơng tan hoặc tan kém trong dung mơi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị mẫu: hồ tan hồn tồn mẫu trong dung mơi thích hợp, cho một lượng silicagel vừa đủ (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ để cĩ thể cơ quay mẫu được khơ hồn tồn) vào rồi đem cất quay đuổi dung mơi đến khơ hồn tồn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung mơi vừa đủ (cao hơn mặt silicagel một ít để khơng bị khơ silicagel và đủ thấm ướt mẫu khơ cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung mơi tránh tạo bọt khí và tránh để mẫu bị vĩn cục. Sau đĩ cho thêm một lớp silicagel mỏng để bảo vệ chất.
- Phương pháp nạp mẫu ướt:
Thường áp dụng khi mẫu tan hồn tồn trong dung mơi chạy cột ban đầu. Lượng dung mơi dùng hồ tan mẫu càng ít càng tốt, vì lớp dung dịch này sẽ dàn trải một lớp mỏng trên cột. Cĩ thể áp dụng tính tốn cụ thể như sau:
Thể tích dung mơi cần lấy để hồ tan mẫu = 0,4.d2 (ml) Với d là đường kính trong của cột tính bằng mm.
Mẫu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho dung mơi trong
cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khố cột. Sau đĩ, cho chất vào và mở khố để mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ dung mơi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch thành cột rồi tiến hành chạy cột (để lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều). Sau đĩ cho một lớp mỏng silicagel lên trên để bảo vệ lớp chất khỏi bị xáo trộn khi cho dung mơi vào [31],[32].