Cây Sổ có tên khoa học là Dillenia indica Linn thuộc họ Dilleniaceae. Ngoài ra cây còn tên khác theo địa phương là cây co má sản, cây voi táo.
Cây mọc rải rác ở vùng rừng núi các tỉnh phía Bắc nước ta, đặc biệt ở các bờ suối. Phân bố ở Tuyên Quang, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Hòa Bình, Hà Tây (Ba Vì, Chùa Hương), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hóa (La Hán), Nghệ An, Khánh Hòa (Nha Trang, Ninh Hòa). Ngoài ra, cây sổ còn phân bố rải rác ở các vùng trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaixia, Inđônêxia [1].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.1. Cây sổ
Hình 2.2. Lá và quả cây sổ
1. Dạng cây: Cây thân gỗ, cao 12-30m, vỏ thân xù xì có những vết sẹo của cuống lá hình lưỡi liềm. Mọc rải rác ở vùng rừng núi các tỉnh phía Bắc nước ta, đặc biệt ở các bờ suối [1], [38].
2. Lá: Lá to hình bầu dục hai đầu nhọn, mép lá có răng cưa rất đều, phiến lá dài 13-30cm, rộng 5-10cm, có từ 15-23 đôi gân nổi rất đều rõ ở mặt dưới [1], [238].
3. Hoa: Hoa to, màu trắng, nhị hoa màu vàng có khả năng phát tán trong không khí. Mùa ra hoa vào tháng 3-5 [11].
4. Quả: Ra hoa vào tháng 3-5, hoa phát triển thành bản dày mọng nước gọi là quả, mùa quả vào tháng 8-10 [4].
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu lá cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lí mẫu
Đối tượng nghiên cứu là lá cây sổ, được thu hái vào tháng 10 năm 2010 tại xã Thái Sơn, huyện Hàm Yên, tỉnh Tuyên Quang.
Mẫu cây đem nghiên cứu hoá thực vật được PGS.TS. Lê Ngọc Công (Khoa Sinh- KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên) giám định tên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
khoa học là Dillenia indica Linn họ thuộc họ Dilleniaceae. Ngoài ra còn có tên là là cây sổ bà, cây thiên biên, người Thái gọi là cây co má sản. Mẫu lá cây tươi sau khi thu hái được sấy ở 800
C để diệt men, sau đó sấy khô ở 500
C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu lá khô đem nghiền nhỏ, ngâm chiết nhiều lần trong dung môi metanol ở nhiệt độ phòng.
Sau khi cất thu hồi dung môi, cặn cô thu được dưới dạng siro lại được hoà với nước cất rồi đem lắc chiết lần lượt với các loại dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần: n-hexan, clorofom, etyl axetat, metanol, các dịch chiết được làm khan bằng Na2SO4 rồi đem cô thu hồi dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500
C dưới áp suất thấp. Các cặn cô tương ứng được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập chất có độ phân cực gần giống nhau, để tinh chế các chất chúng tôi dung phương pháp kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp.
2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết
Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây sổ, chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm:
- Sắc kí lớp mỏng (SKLM).
- Sắc kí cột silicagel ta thường dùng Merck 63- 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.
2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất
Sau khi làm sạch các chất kết tinh, ta xác định được những tính chất vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H- NMR, phổ 13
C- NMR, tuỳ theo từng loại chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng.
2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure). Còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA).
Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được.
Các hệ dung môi khai triển SKLM:
1. n-hexan – etyl axetat 90:10 Hệ A 2. n-hexan – etyl axetat 80:10 Hệ B 3. Clorofom – metanol 70:10 Hệ C 4. Clorofom – metanol 70:30 Hệ D 5. Clorofom – metanol 50:10 Hệ E
Các tấm SKLM sau khi đã bay hết dung môi được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng =254nm và 365nm. Hiện màu bằng thuốc thử là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4, sau đó sấy ở nhiệt độ trên 1000
C.
Các giá trị Rftrong hệ dung môi triển khai có biểu thức:
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức) hoặc trên máy Eletronthermal IA - 9200.
- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410. - Phổ UV đo trên máy UV 1700 Phamaspec.
chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi Rf =
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Phổ khối ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (LC- MS) 70eV và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/ WILLEY 250L.
- Phổ 1
H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, MeOD.
2.3. Các dịch chiết từ lá cây sổ (Dillenia indica Linn) 2.3.1. Các dịch chiết 2.3.1. Các dịch chiết
Lá cây sổ đã sấy khô cân lấy 723,6g và được nghiền nhỏ ngâm chiết kiệt bằng dung môi metanol ở nhiệt độ phòng nhiều lần cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm cho đến dạng cao lỏng, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi n-hexan, etyl axetat, n-butanol. Cuối cùng đuổi hết nước và hoà tan bằng dung môi metanol.
Các dịch chiết trên được làm khan bằng Na2SO4 lọc và cất dung môi bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500
C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng theo sơ đồ 2.1.
Như vậy từ lá cây sổ đã thu nhận được 03 phân đoạn cặn là: cặn trong n-hexan (HD), cặn trong etyl axetat (ED) và cặn trong n-butanol (BuD).
Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết
Mẫu lá khô nghiền nhỏ
n-butanol (BuD) Cặn tổng Metanol
1. MeOH
2. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp
n- hexan (HD)
Etyl axetat (ED)
ED-1 ED-2 ED-3 HD-1 HD-2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn vỏ cây sổ (Dillenia indica Linn)
Khối lƣợng mẫu lá (gam)
Cặn chiết (gam)
n-hexan Etyl axetat n-butanol
723,6 65,531 42,847 41,737
100% 9,056% 5,897% 5,768%
2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết
2.3.2.1. Phát hiện các flavonoit
Cân 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml metanol, đun nóng cho tan rồi lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie (Mg), sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoit.
2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit
Cân 0,01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit.
Ống (1): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
Ống (2): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính.
Ống (3): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính.
2.3.2.3. Định tính các saponin
Cân 0,01g cặn của các phân đoạn. Hoà tan cặn trong 5ml clorofom, lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính.
2.3.2.4. Phát hiện các cumarin
Cân 0,01g cặn của các phân đoạn. Hoà tan cặn trong 5ml clorofom, lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính.
Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính. Nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng sau đó xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là phản ứng dương tính.
Ngoài ra, có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin.
2.3.2.5. Định tính các glucosit tim
Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.4.
+ Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolit.
+ Phản ứng Keller-Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit H2SO4đậm đặc+1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit axetic loãng+1ml FeCl3 5%
Cách tiến hành: cân 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim.
2.3.2.6. Phát hiện các hợp chất steroit
Cân 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml clorofom, lấy dịch clorofom để làm phản ứng định tính các steroit và thuốc thử Lieberman-Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhydrit axetic+1ml clorofom để lạnh ở 00
C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4đậm đặc). Lấy 1ml dịch clorofom rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính.
Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong lá cây Dillenia indica
Linn được nêu trong bảng 2.2.
2.3.2.7. Phát hiện các hợp chất đường khử
Cân 0,01g cặn hòa vào 5ml etanol, lắc đều, lấy dịch etanol làm dịch thử. Lấy 2ml dịch thử vào ống nghiệm và cho thêm vào đó 2ml thuốc thử Felinh, đun sôi 2-3 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch của Cu2O thì chứng tỏ có mặt của đường.
2.3.3. Kết quả khảo sát định tính các dịch chiết
Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lí cao trong lá cây sổ, chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả được chỉ ra ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Phát hiện các nhóm chất trong lá cây sổ (Dillenia indica Linn)
Stt Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tƣợng Kết quả
1 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ +
2 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông -
5 Glicozit tim Keller-Kilian Vàng nâu +
6 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng + 7 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch -
Ghi chú: Dấu (+) là có phản ứng dương tính, (-) là không có phản ứng.
2.3.4. Thử hoạt tính sinh học
Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn tại bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Thái Nguyên.
Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:
Vi khuẩn Gr (-) họ của trực khuẩn gồm: Escherichia coli. Salmonella spp. Shigella spp.
Vi khuẩn Gr (+) họ của cầu khuẩn gồm: Staphylococcus auresu. Streptococcus pyogenes.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 2.3. Ảnh đƣợc gây ức chế xung quanh giếng thạch
Chúng tôi còn tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng của lá cây sổ tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Kết quả thử hoạt tính cặn chiết thô từ lá cây sổ được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của cặn chiết thô từ lá cây sổ (Dillenia indica Linn) từ lá cây sổ (Dillenia indica Linn)
Tên/kí hiệu mẫu dƣợc liệu
Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Staphylococcus auresu Streptococcus pyogenes
Cặn tổng số 18 25 Hoạt tính + + E. coli Salmonella spp Cặn tổng số 13 16 Hoạt tính + + Shigella spp Cặn tổng số 17 Hoạt tính + Chú ý: Dấu (+) là có tác dụng kháng khuẩn.
2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ lá cây sổ
Từ 723,6g lá Dillenia indica Linn khô chiết nhiều lần bằng dung môi metanol đến khi dịch chiết trong suốt không màu. Loại bỏ dung môi rượu bằng máy cất quay ở nhiệt độ 500
C đến khi dịch chiết còn lại ở dạng siro đặc, thêm nước, lắc cặn tổng số này với n-hexan đến khi thu được tất cả các chất có thể tan được trong n-hexan đều được lấy ra hết. Làm khô bằng Na2SO4 sau đó cô cạn dung dịch n-hexan bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ thấp thu được 65,531g chất (kí hiệu các chất HD).
Phần dung dịch không tan trong n-hexan được lắc nhiều lần với etyl axetat cho đến khi dịch chiết etyl axetat hoàn toàn không màu và trong suốt. Cô cạn dịch etyl axetat trong máy cất quay thu được 42,847g chất tổng số (kí hiệu là các chất ED).
Các chất cặn còn lại không tan trong các dung môi trên được chiết bằng n-butanol, làm khô và cô cạn thu được 41,737g chất (kí hiệu là các chất BuD).
2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan
Từ 10g cặn lá cây sổ từ dịch n-hexan kí hiệu (HD) được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexan:etyl axetat với các tỷ lệ tăng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
dần clorofom từ 0% đến 100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5-10ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5%, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất HD-1, HD-2.
2.4.1.1. β- Sitosterol (HD-1)
Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (95:05). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu được 16mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139-140o
C, Rf=0,71 (trong hệ dung môi A). Tiến hành đo phổ chất HD-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,81 (3H, d, j, 7Hz, CH3-26); 0,88 (3H, d, j, 7Hz, CH3-27); 0,83 (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 (3H, d, j, 10Hz, CH3-21); 3,52 (1H, m, H- 3); 5,42 (1H, d, j, 5Hz, H-6). Phổ 13 C-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 37,28 (t, C-1); 33,91 (t, C- 2); 71,83 (d, C-3); 42,32 (t, C-4); 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 31,93 (t, C-7); 31,68 (d, C-8); 50,17 (d, C-9); 36,52 (s, C-10); 21,11 (t, C-11); 39,81 (t, C-12); 42,35 (s, C-13); 56,79 (d, C-14); 24,31 (t, C-15); 28,26 (t, C-16); 56,09