Hợp chất HD-2 thu được từ phần cặn n- hexan là chất rắn màu trắng, sau khi kết tinh lại trong metanol thu được tinh thể hình kim, nóng chảy ở 317-3190C, dễ tan trong dung môi ít phân cực, khó tan trong nước. Phổ FT- IR cho vân hấp thụ mạnh, rộng, tù ở vùng 3466cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH, nhóm liên kết CH chưa no ở 2943cm-1
, vân hấp thụ mạnh ở 1687cm-1
đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm C=O trong axit cacboxylic.
Phổ ESI-MS cho pic [M+H]+
456,2 amu, còn trong phổ DEPT cho biết hợp chất HD-2 có 11 nhóm metilen (CH2), 6 nhóm metin (CH), 6 nhóm metyl (CH3) và 7 nguyên tử cacbon bậc bốn. Từ các dữ liệu trên cho phép xây dựng công thức phân tử của chất HD-2 là C30H48O3.
Phân tích phổ NMR trong vùng trường yếu thấy có pic của nguyên tử cacbon bậc bốn với δC=177,17ppm đặc trưng cho độ chuyển dịch hoá học của cacbon trong nhóm cacboxyl (C28). Tín hiệu ở 150,26ppm đặc trưng cho cacbon bậc 4 có liên kết đôi C=C. Một tín hiệu ở 109,55ppm tương ứng với độ chuyển dịch hóa học của cacbon có liên kết đôi (=CH2), trên phổ HSQC cho thấy hai tín hiệu của hai nguyên tử hiđro này ở δH =4,69ppm (1H, d, J=2Hz) và 4,56ppm (1H, dd, J=4,3Hz). Căn cứ vào các dữ liệu phổ cho thấy các đặc trưng phổ của chất HD-2 phù hợp với các đặc trưng của các chất tritecpenoit có khung cacbon kiểu lupan.
Ở vùng từ trường mạnh phát hiện thấy một nhóm CH mà nguyên tử cacbon này cộng hưởng có δC=76,79ppm, còn nguyên tử hiđro này cộng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hưởng ở δH=3,37ppm (1H, q, J=6 Hz). Các đặc trưng ấy phù hợp với nhóm CHOH ở vị trí C3.
Tín hiệu các proton của sáu nhóm CH3 đều xuất hiện trong vùng mạnh, dưới dạng singlet trong vùng δH từ 0,65-1,64ppm, còn trên phổ 13
C-NMR quan sát thấy các nhóm CH3 trong vùng trường mạnh với δC trong vùng 14,36–27,12ppm.
Kết hợp các thông tin phổ, tính chất vật lí và đặc trưng hoá học cho phép quy kết chất HD-2 là β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit hay còn gọi là axit betulinic. CH2 H3C OH CH3 CH3 CH3 H3C CH3 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 O β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit (HD-2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.4: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.5: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.6: Phổ DEPT của β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit 3.3.3. Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit (ED-1-C35H58O6)
Các số liệu phổ của ED-1 đã trình bày ở mục 2.4.2.1so sánh với số liệu phổ của chất chuẩn stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit là hoàn toàn phù hợp. Các hằng số vật lý của nó cũng như điểm chảy của hỗn hợp ED-1 và stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit là không đổi. Do đó có thể khẳng định hợp chất ED-1 thu được từ lá cây sổ là stigmasta-5,22-dien- 3β-yl-β-D-glucopyranosit. Số liệu phổ 13 C-NMR được ghi ở bảng 3.1) O O OH HO OH HO Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit (ED-1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.7: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9: Phổ DEPT của Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit
Bảng 3.1. Độ dịch chuyển hóa học 13
C.NMR của các chất HD-1, HD-2 và ED-1 trong lá cây sổ
Vị trí β-Sitosterol (HD-1) β-Betunilic (HD-2) Stigmatsterol glucosid (ED-1) 1 37,28 t 38,70 t 36,1 t 2 33,91 t 26,95 t 28,4 t 3 71,83 d 78,78 d 76,7 d 4 42,32 t 38,70 s 3,2 t 5 140,78 s 55,27 s 140,4 s 6 121,73 d 18,18 t 121,1 d 7 31,93 t 34,23 t 31,3 t 8 31,68 d 40,58 s 31,2 d 9 50,17 d 50,45 d 50,5 d 10 36,52 s 37,06 s 36,7 s 11 21,11 t 20,78 t 23,8 t 12 39,81 t 25,43 t 40,0 t 13 42,35 s 38,21 d 41,7 s 14 56,79 d 42,33 s 56,2 d 15 24,31 t 30,49 t 24,8 t 16 28,26 t 32,15 t 29,2 t 17 56,09 d 56,12 s 55,3 d 18 19,41 q 46,87 d 11,8 q 19 12,00 q 49,42 d 20,5 q 20 36,16 d 150,60 s 40,0 d
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 21 19,05 q 29,56 t 18,8 q 22 33,93 t 37,21 t 137,9 d 23 26,14 t 27,78 q 128,9 d 24 45,87 d 15,21 q 49,6 d 25 29,20 d 15,96 q 31,2 d 26 18,79 q 15,78 q 21,1 q 27 19,05 q 14,52 q 20,8 d 28 23,10 t 179,19 s 19,0 t 29 11,99 q 109,35 t 12,0 q 30 - 19,17 q - 1‟ 100,7 d 2‟ 73,4 đ 3‟ 76,9 d 4‟ 70,0 d 5‟ 76,7 d 6‟ 61,0 t
3.2.4. 3,5-đihyđroxy-4’-metoxi-7-O-glucosylflavon (ED-2)
Chất ED-2 là chất rắn vô định hình (15mg) màu vàng sáng, nóng chảy và bị phân hủy ở 2820
C. Phổ 1
H-NMR (500MHz, DMSO, TMS, δ ppm): 12,77 (1H, s) là tín hiệu đặc trưng của nhóm OH ở vị trí C-5 trong các hợp chât flavonoit vì nhóm OH tạo ra vòng với Oxi ở vị trí C-4 bằng liên kết hiđro. Phổ 13
C-NMR và phổ DEPT cho biết chất ED-2 có 22 nguyên tử cacbon bao gồm 1 nhóm CH3, 1 nhóm CH2, 11 nhóm CH và 9 cacbon bậc 4. Nguyên tử C-1 của phần đường cho δC ở 99,87ppm có thể quy kết chất ED-2 tồn tại ở dạng O-glucozit. Độ chuyển dịch hóa học của từng vị trí được trình
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
bày ở bảng 3.2 Căn cứ vào kết quả ghi phổ của chất ED-2, so với phần mềm tính được do mô phỏng của chất 3,5-đihyđroxy-4‟-metoxi-7-O-glucosylflavon cho thấy có sự tương thích rất tốt, với sự sai số cho phép để có thể khẳng định chât ED-2 là 3,5-đihyđroxy-4‟-metoxi-7-O-glucosylflavon.
O OCH3 OH O O OH O OH HO HO OH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.10: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.11: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.5. 4’,5,7-trihidroxi-8-O-glucuronopyranosylflavon (ED-3)
Chất ED-3 thu được sau phân đoạn ED-2, khi rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform- metanol (7:3) sau đó được kết tinh lại trong metanol thu được 16 mg chất rắn màu vàng. Phân tích sơ bộ phổ NMR của chất ED-3 cho thấy cũng tương tự như phổ của chất ED-2 điều này cho biết chất ED-3 cũng là một flavonoit. Khi phân tích chi tiết cho thấy chất ED-3 chỉ có 21 nguyên tử cacbon gồm 11 nhóm CH và 10 cacbon bậc 4, trên phổ DEPT không thấy nhóm CH3 và nhóm CH2. Nguyên tử cacbon của nhóm CH có δC=101,98 và hiđro liên kết với nó có δH=6,68 s chính là cacbon C-3 đặc trưng cho vị trí C-3 của các flavon. Nguyên tử cacbon C-1‟‟ của đường cho δC=106,46 chứng tỏ đường liên kết với flavon bằng liên kết O-glucosyl. Phổ
13
C-NMR còn có 2 cacbon cho độ chuyển dịch hóa học ở trường yếu với δC=181,13 và δC=171,95 chứng tỏ phân tử ED-3 có 2 nhóm C=O trong đó nhóm C=O có δC=181,13 là nhóm C=O tại C-4 còn nhóm C=O có δC=171,95 là nhóm C=O trong nhóm cacboxyl của axit glucuronic. Số liệu chi tiết về phổ NMR của chất ED-3 và số liệu tính toán từ phần mềm của công thức mô phỏng được trình bày ở bảng 3.1. Như vậy từ công thức giả định và phổ NMR chúng tôi ghi được của chất ED-3 có sự phù hợp cao, vì vậy chúng tôi quy kết chất ED-3 là 4‟,5,7-trihidroxi-8-O-glucuronopyranosylflavon. O OH HO O OH O O COOH OH OH OH
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.13: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.14: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.15: Phổ DEPT của 4‟,5,7-trihidroxi-8-O-glucuronopyranosylflavon
Bảng 3.2 Độ chuyển dịch hóa học trong phổ NMR của các chất ED-2 và ED-3
Vị trí Chất ED-2 Chất ED-3 ACD (tính) δC (ppm) δH (ppm) ACD (tính) δC (ppm) δH (ppm) 2 149,54 146,94 163,65 163,27 3 136,30 136,387 102,65 101,97 6,68 s 4 173,50 176,18 182,20 181,13 5 160,50 160,37 152,90 157,34 6 99,20 98,77 6,43, d,J=2 127,90 126,06 7 162,90 162,75 157,40 157,22 8 94,80 94,41 6,82, d,J=2 94,40 100,19 6,69 s 9 156,00 156,72 152,20 152 10 108,33 104,71 104,60 100,90 1‟ 123,10 123,93 121,20 121,27 2‟ 129,30 129,42 8,17 dd 128,15 128,96 8,15 d 3 113,90 114,05 7,14 dd, 115,80 115,88 6,90 d 4‟ 164,90 160,61 160,90 160,92 5‟ 113,90 114,047 7,14; (dd, 115,80 115,88 6,90 d 6‟ 129,30 129,42 8,17; dd, 128,50 128,96 8,15 d 1‟‟ 100,50 99,87 5,13(d,J=5) 103,50 106,46 4,67 d 2‟‟ 73,40 73,08 3,28 73,50 72,89 3,26 m 3‟‟ 76,70 76,39 3,33 75,90 76,42 3,16 m 4‟‟ 70,10 69,54 3,18 m 71,30 72,41 3,58 m 5‟‟ 77,30 77,13 3,45 m 75,50 76,01 3,60 d
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6‟‟ 61,20 60,58 3,46 m 169,9 171,95 4‟. OCH3 55,25 55,35 3,85 s
KẾT LUẬN
1. Nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật của lá cây sổ (Dillenia indica
Linn) đã phát hiện thấy 4 nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao: steroit, saponin, flavonoit, glycozit tim.
2. Từ lá cây sổ lần đầu tiên đã phân lập và dựa vào các đặc trưng hoá lý, các số liệu phổ EI-MS, NMR, FT-IR đã nhận dạng được cấu trúc của 5 hợp chất hữu cơ thuộc các nhóm steroit và flavonoit đó là: β-sitosterol, axit betulinic, 3,5-
đihyđroxy-4‟-metoxi-7-O-glucosylflavon và 4‟,5,7-trihidroxi-8-O- glucuronopyranosylflavon
3. Từ cặn chiết tổng của lá cây sổ (Dillenia indica Linn) có tác dụng với các chủng vi sinh vật thử là: Staphylococcus aureus, E.coli, Salmonella spp, Shigell spp, Streptococcus pyogens.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học – TPHCM, tr. 1057-1059.
2. Bùi Văn Bình (2008), Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn, Thái Nguyên tr. 38-45.
3. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ Tp HCM, Tập 2, tr. 783-796.
4. Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật- Đại học Quốc gia (2003), Danh lục các loài thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tập 2, tr. 322-325.
5. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr. 395.
6. 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới , Hà Nội, (9/1993)].
TIẾNG ANH
7. Andre Nick, Anthony D. Wright, Topul Rali and Otto Sticher (1995),
„„Atibacterial triterpenoids from Dillenia indica papuna and their structure- activity relationships”, Phytochemistry, Vol.40, No. 6, pp.1691-1695.
8. Andre Nick, Anthony D. Wright, Otto Sticher (1994), “Atibacterial triterpenoid acids from Dillenia indica papuna”, Journal of Natural Products, Vol.57 No.9, pp 1245-1250.
9. Albert A. Gurni and Klaus Kubitzki (1981), Flavonoid Chemistry and Systematics of the Dilleniaceae”, Biochemical Systematics and Ecology,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10.Alberto A. Gurni, Wilfried A. Konig and Klaus Kubitzki (1981), “Flavonoid glycosies and sulphates from the dilleniacece”, Phytochemistry, Vol.20, No.5, pp. 1057-1059.
11. Ashoke Bhattacharya, Subrata Mondal & Sudhendu Mandal (1999), “Entomophilous pollen incidence with reference to atmospheric dispersal in eastern India” Aerobiologia, 15. pp. 311-315.
12. Chapman & Hall/CRC, DNP on CD – ROM, 1982-2006, Version 15:1. 13. D.K. Gogoi*, S. Mazumder, R. Saikia, T.C. Bora (2008), “Impact of
submerged culture conditions on growth and bioactive metabdlite produced by endophyte Hypocrea spp. NSF-08 isolated from Dillenia indica Linn. In North- East India. Effet des conditions de culture en milieu liquide sur la croissance et la production de métabolite bioactif d‟ Hypochrea sp. NSF-08 un champignon endophyte isolé de Dillenia indica Linn. Au Nord-Est de l‟ lnde ‟‟, Journal de Mycologie Médicale. 18. pp.1-9.
14. E. C. Bate-Smith Animal Physiology Institute, A.R.C., Babraham, Cambridge and J. B. Harborne (1971), “Differences in flavonoid content between fresh and herbarium leaf tissue in Dillenia”, Phytochemistry,
Vol. 10, pp. 1055-1058.
15. Enim J.A.D.S., Oliveira A.B., Lapa A.J., “Pharmacological evaluation of the anti-inflammatory activity of a citrus bioflavonoids, hesperidin and the isoflavonoids, duartin and claussequinone, in rat and mice”. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1994, Vol 46, p. 118-122.
16. Gabrielska J., Oszmianski J., Zylka R., Komorowska M., “Antioxidant activity flavones from Scutellaria baicalensis in lecithin liposomes”.
Zeitschrift für Naturforschung, 1997, Vol 52c, p. 817-823. (13)
17. Garo E., Maillard M., Antus S., Mavi S., Hostettmann K., “Five flavans from Mariscus psilostachys”. Phytochemistry, 1996, Vol 43, p.1265-1268.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18. Gowsala Pavanasasivam and M. Uvais S. SultanbaWa (1975), “Flavonoids of some Dilleniaceae species”, Phytochemistry, Vol. 14, pp. 1127-1128. 19. G. Pavanasasivam and M. U. S. Sultanbawa (1974), “Betulinic acid in the
Dilleniaceae and a review of its natural distribution”, Phytochemistry, Vol. 13. pp. 2002 -2006.
20. Grayer, R. J. Harbone, J. B. Kimmins, E. M. Stevenson, F. C., Wijayagunasekera, H.N.P., “Phenolics in rice phloem sap as sucking deterrents to the brown plant hopper Nalaparvata lugens.” Acta Horticulturea, 381, 691-694.
21. Grayer, R. J. Harbone. “A survey of antifungal compounds from higher plants 1982-1993”. Phytochemistry, 1994, Vol 37, p. 19-42.
22. Hemanta Kumar Sharma, Babita Sarangi, Siba Prasad Pradhan (2009) “Preparation and in-vitro evaluation of mucoadhesive microbeads containing Timolol Maleate using mucoadhesive substances of Dillenia indica L”,
Arch Pharm Sci & Res, October, Vol 1 No 2. pp. 181-188.
23. Hodnick W.F., Duval D.L., Pardini R.S., “Inhibition of mitochondrial respiration and cyanide-stimulated generation of reactive oxygen species by selective flavonoids”. Biochemical Pharmacology, 1994, Vol 47, p. 573-580. 24. Iniesta-Sanmartin E., Barberan F.A.T., Guirado A., Lorens F.T.,
“Antibacterial flavonoids from Helichsyrum picardii and H. italicum”. Planta Medica, 1990, Vol 56, p. 648-649.
25. (24)(22)Iinuma M., Tsuchiya H., Sato M., Yokoayma J., Ohyama M., “Flavonones with antibacterial activity against Staphylococcus aureusi” 26. Jensen, P.R., Jenkin, K.M. Porter, D., Fenical, W., “A new antibiotic
flavone glycoside chemically defends the sea grass Thalassia testudinum
against zoosporic fungi”. Applied Environmental Microbiology, 1998, Vol 64, p. 1490-1496.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn