từ lá cây sổ (Dillenia indica Linn)
Tên/kí hiệu mẫu dƣợc liệu
Đƣờng kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch (mm)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Staphylococcus auresu Streptococcus pyogenes
Cặn tổng số 18 25 Hoạt tính + + E. coli Salmonella spp Cặn tổng số 13 16 Hoạt tính + + Shigella spp Cặn tổng số 17 Hoạt tính + Chú ý: Dấu (+) là có tác dụng kháng khuẩn.
2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ lá cây sổ
Từ 723,6g lá Dillenia indica Linn khô chiết nhiều lần bằng dung môi metanol đến khi dịch chiết trong suốt không màu. Loại bỏ dung môi rượu bằng máy cất quay ở nhiệt độ 500
C đến khi dịch chiết còn lại ở dạng siro đặc, thêm nước, lắc cặn tổng số này với n-hexan đến khi thu được tất cả các chất có thể tan được trong n-hexan đều được lấy ra hết. Làm khô bằng Na2SO4 sau đó cô cạn dung dịch n-hexan bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ thấp thu được 65,531g chất (kí hiệu các chất HD).
Phần dung dịch không tan trong n-hexan được lắc nhiều lần với etyl axetat cho đến khi dịch chiết etyl axetat hoàn toàn không màu và trong suốt. Cô cạn dịch etyl axetat trong máy cất quay thu được 42,847g chất tổng số (kí hiệu là các chất ED).
Các chất cặn còn lại không tan trong các dung môi trên được chiết bằng n-butanol, làm khô và cô cạn thu được 41,737g chất (kí hiệu là các chất BuD).
2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan
Từ 10g cặn lá cây sổ từ dịch n-hexan kí hiệu (HD) được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexan:etyl axetat với các tỷ lệ tăng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
dần clorofom từ 0% đến 100%. Dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (5-10ml/phân đoạn). Kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5%, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất HD-1, HD-2.
2.4.1.1. β- Sitosterol (HD-1)
Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (95:05). Sau khi cất loại dung môi, cặn thu kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện nó bằng vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexan thu được 16mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139-140o
C, Rf=0,71 (trong hệ dung môi A). Tiến hành đo phổ chất HD-1 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,81 (3H, d, j, 7Hz, CH3-26); 0,88 (3H, d, j, 7Hz, CH3-27); 0,83 (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 (3H, d, j, 10Hz, CH3-21); 3,52 (1H, m, H- 3); 5,42 (1H, d, j, 5Hz, H-6). Phổ 13 C-NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 37,28 (t, C-1); 33,91 (t, C- 2); 71,83 (d, C-3); 42,32 (t, C-4); 140,78 (s, C-5); 121,73 (d, C-6); 31,93 (t, C-7); 31,68 (d, C-8); 50,17 (d, C-9); 36,52 (s, C-10); 21,11 (t, C-11); 39,81 (t, C-12); 42,35 (s, C-13); 56,79 (d, C-14); 24,31 (t, C-15); 28,26 (t, C-16); 56,09 (d, C-17); 19,41 (q, C-18); 12,00 (q, C-19); 36,16 (d, C-20); 19,05 (q, C-21); 33,93 (t, C-22); 26,14 (t, C-23); 45,87 (d, C-24); 29,20 (d, C-25); 18,79 (q, C-26); 19,05 (q, C-27); 23,10 (t, C-28); 11,99 (q, C-29).
2.4.1.2. Axit betulinic hay 3β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid (HD-2)
Rửa giải trên cột bằng hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (90:10), sau khi kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi B, cất loại dung môi, thu được chất rắn màu trắng, sau khi kết tinh lại trong metanol thu được 56mg chất rắn tinh thể hình kim, có tn/ckhoảng 316-3180
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Phổ 1 H-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 3,19 (1H, d, J=4,9Hz); 3,87 (1H, d, J=2Hz); 3,38 (1H, d, J=2Hz); 0.69-1,69 (H, s, 6-Me). PHổ 13 C-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 37,01 (t, C-1); 26,95 (t, C- 2); 78,78 (d, C-3); 38,70 (s, C-4); 55,27 (t, C-5); 18,18 (q, C-6); 32,16 (t, C- 7); 40,58 (t, C-8); 50,45 (d, C-9); 37,06 (d, C-10); 20,78 (q, C-11); 25,43 (q, C-12); 38,21 (d, C-13); 42,33 (t, C-14); 30,49 (t, C-15); 34,24 (d, C-16); 56,12 (d, C-17); 49,13 (t, C-18); 46,84 (d, C-19); 150,60 (s, C-20); 29,56 (t, C-21); 38,65 (d, C-22); 27,78 (t, C-23); 15,21 (q, C-24); 15,96 (q, C-25); 15,78 (q, C-26); 14,52 (q, C-27); 179,19 (s, C-28); 109,35 (s, C-29); 19,17 (q, C-30).
2.4.2. Cặn dịch chiết etyl axetat
Dịch chiết etyl axetat làm khan bằng Na2SO4, sau đó cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn thô. Từ 10g cặn thô EtOAc đem tách trên cột silicagel. Rửa giải cột bằng hệ dung môi clorofom:metanol tăng dần theo độ phân cực (0:100%), dịch rửa giải thoát ra từ cột được thu ở những khoảng cách nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu được bằng sắc ký lớp mỏng
và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% sau đó các phân đoạn giống nhau được dồn lại rồi đem cất loại dung môi thu được ba chất sạch là ED-1, ED-2và ED-3.
2.4.2.1. Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit (ED-1-C35H58O6)
Thay đổi hệ dung môi rửa giải cột clorofom - metanol theo tỷ lệ 90:10 thu được khối chất rắn vô định hình. Kết tinh lại trong metanol thu được tinh thể hình kim không màu, điểm chảy 296-298 0
C. Rf = 0,67 (trong hệ dung môi C) Phổ 1
H-NMR (500MHz, CDCl3, TMS, δ ppm): 3,41 (1H, m, H3α); 5,32 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H-6); 5,11 (1H, dd, J=15Hz và 5Hz, H-22); 5,03 (1H, dd, J=15Hz và 5Hz, H-23); 1,00 (3H, s, H-18); 0,95 (3H, d, J21-20 = 6,4Hz, H-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21); 0,85 (3H, d, J26-25 = 7,2Hz, H-26); 0,83 (3H, d, J29-27 = 6,5Hz, H-29);0,80 (3H, d, J28-27 = 6,5Hz, H-28); 0,70 (3H, s, H-19); 4,3 (d, J1‟-2‟ = 7,8Hz, H-1‟ phần đường); và các tín hiệu của các proton thuộc các C carbinol phần đường glucozơ có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 3,2 – 3,9 ppm.
Phổ 13 C-NMR (125MHz, DMSO, TMS, δ ppm): Phần genin: 38,1 (t, C-1); 29,5 (t, C-2); 71,7 (d, C-3); 42,2 (t, C-4); 140,6 (s, C-5);120,8 (d, C-6) ; 38,2 (t, C-7); 31,5 (d, C-8); 50,3 (d, C-9); 36,0 (s, C-10); 24,4 (t, C-11); 38,2 (t, C-12); 31,5 (s, C-13); 56,1 (d, C-14); 25,6 (t, C-15); 31,1 (t, C-16); 55,4 (d, C-17); 15,0 (q, C-18); 18,6 (q, C-19); 45,1 (d, C-20); 20,8 (q, C-21); 137,5 (d, C-22); 128,7 (d, C-23); 49,5 (d, C-24); 33,2 (d, C-25); 20,5 (q, C-26); 19,3 (d, C-27); 18,8 (q, C-28); 11,7 (q, C-29). Phần đường gồm: 100,7 (d, C-1‟); 73,3 (d, C-2‟); 76,4 (d, C-3‟); 70,1 (d, C-4‟); 76,9 (d, C-5‟); 61,9 (d, C-6‟).
2.4.2.2. 3,5-đihyđroxy-4’-metoxi-7-O-glucosylflavon(ED-2)
Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi clorofom -metanol theo tỷ lệ 80:20 thu được khối chất rắn dưới dạng bột vàng. Khối chất rắn này lại tinh chế trên cột silicagel cỡ hạt 0,040 - 0,063mm, hệ dung môi rửa giải cloroform - metanol tỷ lệ 80:20 thu đượcchất rắn vô định hình (15mg) màu vàng sáng, nóng chảy và bị phân hủy ở 2820
C, Rf = 0,71 (trong hệ dung môi D). Phổ 1
H-NMR (500MHz, DMSO, TMS, δ ppm):. 6,43 (1H, d, J=2) ; 6,82 (1H, d, J=2) ; 8,17 (1H, m) ; 7,14 (1H, m) ; 7,14 (1H, m) ; 8,17 (1H, m) ; 5,13 (1H, d, J=5) ; 3,18-3,85. 12,77 (1H, s ) là tín hiệu đặc trưng của nhóm OH ở vị trí C-5 trong các hợp chất flavonoit vì nhóm OH tạo ra vòng với Oxi ở vị trí C-4 bằng liên kết hiđro.
Phổ 13C-NMR (500MHz, DMSO, TMS); (ppm): 146,94 (s, C-2); 136,38 (s, C-3); 176,18 (s, C-4); 160,37 (d, C-5); 98,77 (t, C-6); 162,75 (s, C- 7); 94,41 (t, C-8); 156,72 (s, C-9); 104,71 (s, C-10); 123,93 (s, C-1‟); 129,42
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(d, C-2‟); 114,05 (d, C-3‟); 160,61 (s, C-4‟); 114,04 (d, C-5‟); 129,42 (d, C- 6‟); 99,87 (d, C-1”); 73,08 (d, C-2”); 76,39 (d, C-3”); 69,54 (d, C-4”); 77,13 (d, C-5”); 60,58 (t, C-6”); 55,35 (q, OCH3).
2.4.2.4‟,5,7-trihidroxi-8-O-glucuronopyranosylflavon(ED-3)
Chất ED-3 thu được sau phân đoạn ED-2, khi rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi clorofom:metanol (70:30) sau đó được kết tinh lại trong metanol thu được 16 mg chất rắn màu vàng, nóng chảy từ 310- 312o
C, Rf= 0,68 (trong hệ dung môi E).
Phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO, δ ppm): 6,68 (1H, s-C3); 6,69 (1H, s, C-8); 8,15 (1H, m, C-2‟); 6,90 (1H, m, C-3‟); 6,90 (1H, d, C-5‟); 8,15 (1H, d, C-6‟); 4,67 (1H, d, C-1”); 3,26 (1H, m, C-2”); 3,16 (1H, m, C-3”); 3,58 (1H, m, C-4”); 3,60 (1H, d, C-5”). Phổ 13 C-NMR (125MHz, DMSO, TMS, δ ppm): 163,27 (s, C-2); 101,97 (d, C-3); 181,13 (s, C-4); 149,34 (s, C-5); 126,06 (s, C-6); 157,22 (s, C-7); 100,19 (d, C-8); 152 (s, C-9); 100,90 (s, C-10); 121,27 (s, C-1‟); 128,96 (d, C-2‟); 115,88 (d, C-3‟); 160,92 (s, C-4‟); 115,88 (d, C-5‟); 128,96 (d, C- 6‟); 106,46 (d, C-1”); 72,89 (d, C-2”);76,42 (d, C-3”); 72,41 (d, C-4”) 76,01 (d, C-5”); 171,95 (s, C-6”).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung.
Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp.
Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau:
1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, clorofom, etyl axetat, metanol hoặc etanol v.v....
2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau.
Quá trình ngâm chiết lá của cây Sổ bà (Dillenia indica Linn) được thực hiện theo phương án 1 (Sơ đồ 2.1).
3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của lá cây (Dillenia indica Linn) nhau của lá cây (Dillenia indica Linn)
Các dịch chiết từ lá của cây Sổ bà (Dillenia indica Linn) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, cúng tôi đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: cột nhồi silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ lá của cây Sổ bà được thực hiện như sơ đồ 2.1 và đã thu được 5 hợp chất sạch gồm các nhóm chất: sterol, terpenoit và flavonoit.
3.3.1. β-sitosterol (HD-1)
Chất HD-1 là chất rắn tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy 140- 1410C, nó được tách từ dịch chiết n-hexan, trong hệ dung môi n-hexan:etyl axetat (95:05).
Phổ EI- MS, m/z (%) cho [M+
] = 414, [M-1]+ = 413. Từ phổ EI-MS cho pic [M+
] = 414amu ứng với công thức phân tử C29H50O. Phổ hồng ngoại, phổ 1
H-NMR và phổ 13
C-NMR cho thấy trong phân tử có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450cm-1
rộng, δH-3α =3,57ppm và δC-3 = 72,1ppm). Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax=3010cm-1 và 1650cm-1 ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ 1
H-NMR cho δH-6 = 5,42ppm (1H, d, J=5,2Hz), phổ 13
C-NMR cho δC-5=141,1ppm và δC-6 = 121,7ppm). So sánh các số liệu phổ 1
H-NMR và 13C-NMR của chất HD-1 với số liệu phổ NMR của β-sitosterol hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.2.
Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất HD-1 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn HO 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 18 12 13 17 16 19 21 22 24 26 27 28 29 11 14 15 23 25 20 β-sitosterol(HD-1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.1: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.2: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.2.-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit (HD-2).
Hợp chất HD-2 thu được từ phần cặn n- hexan là chất rắn màu trắng, sau khi kết tinh lại trong metanol thu được tinh thể hình kim, nóng chảy ở 317-3190C, dễ tan trong dung môi ít phân cực, khó tan trong nước. Phổ FT- IR cho vân hấp thụ mạnh, rộng, tù ở vùng 3466cm-1
đặc trưng cho dao động hóa trị của nhóm OH, nhóm liên kết CH chưa no ở 2943cm-1
, vân hấp thụ mạnh ở 1687cm-1
đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm C=O trong axit cacboxylic.
Phổ ESI-MS cho pic [M+H]+
456,2 amu, còn trong phổ DEPT cho biết hợp chất HD-2 có 11 nhóm metilen (CH2), 6 nhóm metin (CH), 6 nhóm metyl (CH3) và 7 nguyên tử cacbon bậc bốn. Từ các dữ liệu trên cho phép xây dựng công thức phân tử của chất HD-2 là C30H48O3.
Phân tích phổ NMR trong vùng trường yếu thấy có pic của nguyên tử cacbon bậc bốn với δC=177,17ppm đặc trưng cho độ chuyển dịch hoá học của cacbon trong nhóm cacboxyl (C28). Tín hiệu ở 150,26ppm đặc trưng cho cacbon bậc 4 có liên kết đôi C=C. Một tín hiệu ở 109,55ppm tương ứng với độ chuyển dịch hóa học của cacbon có liên kết đôi (=CH2), trên phổ HSQC cho thấy hai tín hiệu của hai nguyên tử hiđro này ở δH =4,69ppm (1H, d, J=2Hz) và 4,56ppm (1H, dd, J=4,3Hz). Căn cứ vào các dữ liệu phổ cho thấy các đặc trưng phổ của chất HD-2 phù hợp với các đặc trưng của các chất tritecpenoit có khung cacbon kiểu lupan.
Ở vùng từ trường mạnh phát hiện thấy một nhóm CH mà nguyên tử cacbon này cộng hưởng có δC=76,79ppm, còn nguyên tử hiđro này cộng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
hưởng ở δH=3,37ppm (1H, q, J=6 Hz). Các đặc trưng ấy phù hợp với nhóm CHOH ở vị trí C3.
Tín hiệu các proton của sáu nhóm CH3 đều xuất hiện trong vùng mạnh, dưới dạng singlet trong vùng δH từ 0,65-1,64ppm, còn trên phổ 13
C-NMR quan sát thấy các nhóm CH3 trong vùng trường mạnh với δC trong vùng 14,36–27,12ppm.
Kết hợp các thông tin phổ, tính chất vật lí và đặc trưng hoá học cho phép quy kết chất HD-2 là β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit hay còn gọi là axit betulinic. CH2 H3C OH CH3 CH3 CH3 H3C CH3 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 O β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit (HD-2)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.4: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.5: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.6: Phổ DEPT của β-hidroxy-lup-20(29)-en-28-oic axit 3.3.3. Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit (ED-1-C35H58O6)
Các số liệu phổ của ED-1 đã trình bày ở mục 2.4.2.1so sánh với số liệu phổ của chất chuẩn stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit là hoàn toàn phù hợp. Các hằng số vật lý của nó cũng như điểm chảy của hỗn hợp ED-1 và stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit là không đổi. Do đó có thể khẳng định hợp chất ED-1 thu được từ lá cây sổ là stigmasta-5,22-dien- 3β-yl-β-D-glucopyranosit. Số liệu phổ 13 C-NMR được ghi ở bảng 3.1) O O OH HO OH HO Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit (ED-1)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.7: Phổ 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.8: Phổ 13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9: Phổ DEPT của Stigmasta-5,22-dien-3β-yl-β-D-glucopyranosit
Bảng 3.1. Độ dịch chuyển hóa học 13
C.NMR của các chất HD-1, HD-2 và ED-1 trong lá cây sổ
Vị trí β-Sitosterol (HD-1) β-Betunilic (HD-2) Stigmatsterol glucosid (ED-1) 1 37,28 t 38,70 t 36,1 t 2 33,91 t 26,95 t 28,4 t 3 71,83 d 78,78 d 76,7 d 4 42,32 t 38,70 s 3,2 t 5 140,78 s 55,27 s 140,4 s 6 121,73 d 18,18 t 121,1 d 7 31,93 t 34,23 t 31,3 t 8 31,68 d 40,58 s 31,2 d 9 50,17 d 50,45 d 50,5 d 10 36,52 s 37,06 s 36,7 s 11 21,11 t 20,78 t 23,8 t 12 39,81 t 25,43 t 40,0 t 13 42,35 s 38,21 d 41,7 s 14 56,79 d 42,33 s 56,2 d