2.5.1 .Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
2.5.5. Phương pháp thử kháng sinh đồ
Phương pháp kháng sinh đồ dựa trên sự khuếch tán của kháng sinh trên thạch đĩa của Kirby-Bauer, dựa trên đường kính vịng vơ khuẩn theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999) để đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh.
Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P. multocida được cấy vào môi trường BHI, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ. Dùng pipet Pasteur lấy 0,1- 0,2 ml canh trùng, nhỏ 3-5 giọt vào đĩa thạch, láng đều, để 3-5 phút cho khô mặt thạch. Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy đã tẩm các loại kháng sinh lên mặt thạch đặt cách nhau 20mm. Sau 15 phút thì lật úp đĩa thạch vào tủ ấm 370C. Đọc kết quả và đánh giá khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng cách đo đường kính vịng vơ khuẩn. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất, Code 1332 E. Kết quả đánh giá theo bảng hướng dẫn của nhà sản xuất. Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa và đánh giá theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999).
* Phương pháp tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 370C. Lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1,5ml nước sinh lý để đạt được độ đục
0,5 trong dãy so màu Mc Farland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều trên thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất lên mặt đĩa thạch. Khoảng cách đều 2cm, mỗi đĩa đặt từ 6-8 khoanh.
+ Bước 4: Bồi dưỡng đĩa thạch ở 370C trong 18 - 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vịng vơ khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
Kết quả được đọc bằng cách: dùng thước mm để đo đường kính của vịng vơ khuẩn, đo phía sau mặt đĩa thạch. Nếu cạnh của vịng vơ khuẩn khơng rõ nét thì phải đo chỗ hẹp nhất và rộng nhất rồi lấy giá trị trung bình (đường kính của vịng vơ khuẩn được tính bằng mm). Nếu khuẩn lạc mọc trong vịng vơ khuẩn vi khuẩn rõ ràng thì phải ni cấy, phân lập và thử lại. Kết quả kháng sinh đồ được ứng dụng điều trị với vi khuẩn còn mẫn cảm với thuốc kháng sinh, khi vi khuẩn đã kháng thuốc tức vịng vơ khuẩn dưới mức diệt khuẩn thì khơng được dùng. Không dùng thuốc kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng lại để điều trị bệnh.
Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm của từng kháng sinh (theo Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ, 1999):
+ Rất mẫn cảm: ϕ> 20mm
+ Mẫn cảm trung bình: ϕ 13-20mm + Kháng thuốc: ϕ< 13mm
Trên cở sở kết quả thử tính mẫn cảm trung kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được để tiến hành lựa chọn sản phẩm thuốc điều trị bệnh thương mại với từng thành phần kháng sinh có mức độ mẫn cảm ϕ>20mm.