2.5.1 .Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học
2.5.6. Phương pháp PCR (theo Nagai et al., 1994)
- Cách tiến hành tách chiết DNA.
* Tách chiết DNA bằng Kit QIAgen
Bước 1: Dùng pipet hút 20µl Proteinase K vào ống eppendorf 1,5ml, thêm
100 µl mẫu và cho thêm PBS cho đủ 220 µl. Để bất hoạt RNA trong phản ứng thì bổ sung thêm 4µl RNase A (100mg/ml), ủ ở nhiệt độ phòng trong 2phút.
Bước 2: Cho 200 µl đệm Buffer AL và trộn đều bằng vortex trong 15 giây. Ủ ở 560C trong 10 phút.
Bước 4: Chuyển phần dịch pha trộn từ bước 3 trên vào cột DNeasy
Mini spin, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 5: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW1 khơng để rơi lên thành, miệng, đóng nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 6: Đặt cột vào ống 2ml sạch mới. Cẩn thận mở nắp cột DNeasy Mini spin, thêm 500µl Buffer AW2 và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút và loại bỏ phần dung dịch ở phía dưới.
Bước 7: Đặt cột DNeasy Mini spin sang ống 1,5 ml mới và loại bỏ phần
dung dịch ở phía dưới. Thêm 200 µl đệm AE trực tiếp lên màng DNeasy. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới.
Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa DNA tổng số. Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -200C hoặc -700C.
- Cách tiến hành chạy PCR. (theo Nagai et al, 1994).
Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng 2.1:
Bảng 2.1. Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida
(Theo Smith JE, 1959)
Đặc tính sinh hóa Kết quả
Dung huyết - Glucose + Lactose - H2S - Catalaza + Oxidase + Indol + Ureaza -
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt ở bảng 2.2:
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR phát hiện Pasterella multocida Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Duỗi mạch 95 2 phút 1
2
Duỗi mạch 94 30 giây
30
Gắn mồi 50 30 giây
Tổng hợp sợi mới 72 60 giây
3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1
4 Giữ sản phẩm 4 ∞
Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng như sau:
Tên mồi Trình tự (NU)(Nagai et al., 1994) Kích thước sản phẩm
Mồi xi ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG
457bp Mồi ngược GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC
- Cách tiến hành điện di trên gel agarose đọc kết quả
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1x hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lị vi sóng ở 1000C trong 5 phút, để nguội 45-500C bổ sung 10µl Red gel (nồng độ 10µg/10µl). Sau đó đổ vào khn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel. Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào bể điện di và đổ đung dịch đệm TBE ngập bản gel.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2 µl loading dye vào 8 µl sản phẩm PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA thường sử dụng từ 4-6 µl DNA marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Đọc kết quả
Sau khi điện di, vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng máy phát tia UV. Sau đó chụp ảnh và lưu kết quả.
- Mẫu dương tính với vi rút khi giếng chứa mẫu điện di xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen nhân lên 457bp.
- Mẫu âm tính khi khơng xuất hiện vạch DNA tương ứng với độ dài đoạn gen khuếch đại.