Hình 3 .2 Hình thái thân cây hoắc hƣơng
Hình 3.14 Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến chiều dài rễ của cây
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng chiều dài rễ không bị ảnh hƣởng bởi các nồng độ IAA khác nhau. Chiều dài rễ ở các công thức CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lƣợt bằng 22,87; 20,76; 17,51 và 20,43 cm. Tuy nhiên, sự sai khác giữa chiều dài rễ ở các công thức thí nghiệm không có ý nghĩa thống kê.
Chiều dài rễ (cm)
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến nhân giống cây Hoắc hƣơng bằng công nghệ in vitro bằng công nghệ in vitro
3.3.1. Ảnh hưởng của cytokinin đến nhân nhanh chồi in vitro
Mẫu sau tái sinh từ vật liệu ban đầu đƣợc lƣu giữ tại Trung tâm Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu Ứng dụng và Phát triển đƣợc sử dụng làm vật liệu trong nghiên cứu ảnh hƣởng của cytokinin đến nhân nhanh chồi in vitro. Cụm chồi sau khi tái sinh chuyển sang môi trƣờng MS cải tiến bổ sung BAP và Kinetin riêng rẽ với nồng độ khác nhau (BAP ở nồng độ 0,5; 1,0; 1.5 và 2 mg/l, Kinetin ở nồng độ 0,5; 1,0; 1.5 và 2 mg/l) và công thức đối chứng không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng.
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP và Kinetin đến sự nhân nhanh chồi sau 4 tuần cấy mẫu đƣợc thể hiện trong bảng 3.6
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi (sau 4 tuần)
Công thức CĐHST ( mg/l) Hệ số nhân chồi ( lần) Hình thái chồi CT0 0 2,41 ± 0,21 Chồi xanh nhỏ mảnh mọng nƣớc
CT1 0,5mg/l BAP 1,36 ± 0,24 Chồi nhỏ màu xanh có hiện tƣợng
phát sinh mô sẹo
CT2 1,0mg/l BAP 1,27 ± 0,16 Chồi nhỏ màu xanh nhạt có hiện
tƣợng phát sinh mô sẹo
CT3 1,5mg/l BAP 1,18 ± 0,14 Phát sinh mô sẹo
CT4 2,0mg/l BAP 1,10 ± 0,23 Phát sinh mô sẹo hóa nâu
CT5 0,5mg/l Ki 1,32 ± 0,13 Chồi nhỏ màu xanh có hiện tƣợng
phát sinh mô sẹo
CT6 1,0mg/l Ki 1,18 ± 0,25 Chồi nhỏ màu xanh có hiện tƣợng
CT7 1,5mg/l Ki 1,27 ± 0,24 Phát sinh mô sẹo
CT8 2,0mg/l Ki 1,09 ± 0,15 Phát sinh mô sẹo, hóa nâu
Kết quả bảng 3.6 cho thấy, cả hai chất điều hòa sinh trƣởng BAP và Kinetin đều có ảnh hƣởng đến hệ số nhân chồi và chiều cao chồi Hoắc hƣơng
in vitro. So với đối chứng, các công thức có bổ sung BAP và kinetin ở các
nồng độ khác nhau đều có hệ số nhân chồi giảm xuống, đồng thời, có hiện tƣợng phát sinh mô sẹo. Hệ số nhân chồi ở các công thức có bổ sung BAP (CT1-CT4) có hệ số nhân chồi lần lƣợt bằng 1,36; 1,27; 1,18 và 1,10. Hệ số nhân chồi ở các công thức có bổ sung kinetin ở các nồng độ khác nhau lần lƣợt bằng 1,32; 1,18; 1,27 và 1,09. Trong khi đó, ở công thức đối chứng, hệ số nhân chồi đƣợc ghi nhận bằng 2,41. Riêng ở các công thức có bổ sung BAP hoặc kinetin nồng độ 1,5 hoặc 2,0 mg/l, sự phát sinh mô sẹo tăng mạnh. Đặc biệt ở nồng độ 2 mg/l, mô sẹo có hiện tƣợng hóa nâu. Riêng ở công thức đối chứng, chồi có dạng mảnh, màu xanh, mọng nƣớc.
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng BAP và Kinetin đến hệ số nhân chồi
Nhƣ vậy, việc bổ sung BAP và kinetin, hai loại cytokinin thƣờng đƣợc
Chồi/ Mẫu
sử dụng trong nuôi cấy mô, đã không làm tăng hiệu quả nhân chồi. Kết quả nghiên cứu này tƣơng đối khác biệt với kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP và kinetin đối với quá trình nhân chồi in vitro của một số đối tƣợng thực vật khác nhƣ cây sâm núi Dành (Đồng Thị Kim Cúc và cộng sự, 2017), cây ba kích (Hoàng Thị Thế và cộng sự, 2013). Đồng thời, kết quả nghiên cứu này cũng khác với kết quả nghiên cứu của Kumara Swamy và nnk (2010). Khi tiến hành nhân nhân giống in vitro cây hoắc hƣơng trực tiếp từ đoạn thân trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,5 mg/l BA đã tạo hệ số nhân chồi bằng 45,66 chồi/đoạn thân. Khi chuyển các chồi này sang môi trƣờng có 0,5 mg/l BA hoặc kinetin tạo ra số chồi trung bình 62,45 chồi [45].
Hoặc gần đây, Hardjo và nnk (2019) cũng nghiên cứu nhân chồi in vitro
cây Hoắc hƣơng. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng môi trƣờng có bổ sung 0,2 ppm BAP và 0,2 ppm kinetin tạo ra hệ số nhân chồi tới 82,19 [42].
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu này lại tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro cây Hoắc hƣơng trong một số báo cáo khác trƣớc đây. Posa và nnk đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Hoắc hƣơng trên môi trƣờng ½ MS. Lần cấy đầu tiên trên môi trƣờng Fossard đã tao đƣợc hệ số nhân chồi bằng 3 [48].
Zulkarnain (2004) khi nghiên cứu nhân giống in vitro cây Hoắc hƣơng đã báo cáo rằng chồi non khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP (1.1, 1.4, 1.7, và 2.0 ppm) đã cảm ứng tạo thành mô sẹo sau hai tuần nuôi cấy [59].
Tƣơng tự, ngay trong nghiên cứu của Kumara Swamy và nnk (2010) cũng cho thấy, ở hàm lƣợng cao hơn 0,5 mg/l, BA và kinetin cảm ứng tạo thành mô sẹo [45]
Trong tất cả các công thức nghiên cứu ở thí nghiệm này, chồi đƣợc hình thành đều có dạng mọng nƣớc, cho thấy chồi chƣa hoàn toàn đảm bảo chất lƣợng để thuận lợi cho giai đoạn tiếp theo. Chính vì vậy cần tiếp tục nghiên
cứu bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy các chất cần thiết để chồi phát triển tốt đảm bảo chất lƣợng cho cây con sau này.
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng BAP và Kinetin với nồng độ khác nhau đến hình thái chồi Hoắc hƣơng
3.3.2. Ảnh hưởng của nước dừa đến sự nhân chồi in vitro của cây Hoắc hương Pogostemon cablin (Blanco) Benth.
Nƣớc dừa là nguồn dinh dƣỡng dồi dào, cung cấp nguồn đạm (từ nhiều loại acid amin, axit hữu cơ) và cacbohydrat (nhƣ glucoza, fructoza, sucroza). Ngoài ra, trong nƣớc dừa, còn chứa một số chất điều hòa sinh trƣởng, đƣợc biết đến nhiều nhất là Zeatin [20]. Do vậy, nƣớc dừa thƣờng đƣợc bổ sung vào mối trƣờng nuôi cấy để đạt hiệu quả mong muốn.
Trong nghiên cứu này, nƣớc dừa ở các hàm lƣợng từ 50 ml/l đến 200 ml/l đã đƣợc sử dụng. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.7 và hình 3.17.
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc dừa đến sự nhân chồi in
vitro của cây Hoắc hƣơng (sau 4 tuần)
Công thức Nƣớc dừa (ml/l) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá) Hình thái chồi ĐC 0 2,41 ± 0,21 2,28± 0,13 3,56± 0,12 Chồi xanh , mọng nƣớc CT1 50 2,5 ± 0,11 2,72± 0,23 3,44± 0,18 Chồi xanh, mọng nƣớc
CT2 100 2,87 ± 0,21 2,81± 0,16 3,78±0,08 Chồi xanh, khỏe
CT3 150 2,38 ± 0,1 2,42± 0,15 3,11±0,13 Chồi xanh, khỏe
CT4 200 2,37 ± 0,18 2,35± 0,17 3,34±0,15 Chồi xanh mọng
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc dừa đến sự nhân chồi in
vitro của cây Hoắc hƣơng.
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.7 cho thấy nƣớc dừa có ảnh hƣởng khác nhau đến hiệu quả nhân chồi Hoắc hƣơng in vitro, cả về hệ số nhân chồi lẫn hình thái chồi. Thực vậy, khi bổ sung nƣớc dừa ở các nồng độ 50, 100, 150 và 200 ml/l vào môi trƣờng nuôi cấy, hệ số nhân chồi thu đƣợc lần lƣợt bằng 2,5; 2,87; 2,38 và 2,37. Trong khi hệ số nhân chồi ở công thức đối chứng bằng 2,41. Nhƣ vậy, việc bổ sung nƣớc dừa đạt hiệu quả cao nhất và cao hơn so với đối chứng ở nồng độ 100 ml/l. Ở các nồng độ còn lại, hệ số nhân chồi giảm xuống, tƣơng đƣơng với đối chứng.
Bên cạnh hệ số nhân chồi, nƣớc dừa còn ảnh hƣởng đến chiều cao chồi. Chiều cao chồi thu đƣợc ở các công thức ĐC, CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lƣợt bằng 2,28; 2,72; 2,81; 2,42 và 2,35. Bổ sung nƣớc dừa ở các nồng độ 50 và 100 ml/l làm chiều cao chồi cao hơn đối chứng có ý nghĩa thống kê trong khi chiều cao chồi ở các công thức bổ sung 150 và 200 ml/l giảm xuống, tƣơng đƣơng với ĐC.
Chồi/ Mẫu
Số lá/chồi sau bốn tuần nuôi cấy cũng chịu ảnh hƣởng của nƣớc dừa. Ở nồng độ 100 nl/l, nƣớc dừa làm tăng số lá/chồi có ý nghĩa thống kê so với ĐC. Trong khi ở các nồng độ khác, số lá/chồi tƣơng đƣơng với ĐC.
Hình thái chồi ở các công thức CT2 và CT3 là chồi xanh, khỏe, trong khi ở các công thức còn lại là chồi xanh nhƣng mọng nƣớc. Nhƣ vậy, bổ sung nƣớc dừa ở nồng độ 100 và 150 ml/l có tác dụng cải thiện chất lƣợng chồi hoắc hƣơng in vitro.
Nhƣ vậy, có thể thấy rằng nƣớc dừa ở nồng độ 100 ml/l có tác dụng tốt nhất đối với sự nhân chồi Hoắc hƣơng in vitro. Kết quả nghiên cứu này khẳng định hiệu quả của nƣớc dừa đối với quá trình nhân chồi in vitro, tƣơng tự với kết quả khi Dƣơng Tiến Nhựt và cộng sự (2009) trong nghiên cứu ảnh hƣởng của nƣớc dừa và saccarose lên sự tăng sinh mô sẹo và sự hình thành phôi vô tính ở loài lan Hồ điệp (Phalaenopsis amabilis) [20].
H nh 3.18. Hoắc hƣơng dƣới ảnh hƣởng của nồng độ nƣớc dừa khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy
3.3.3. Ảnh hưởng của vitamin B1 đến sự nhân chồi in vitro của cây Hoắc hương Pogostemon cablin (Blanco) Benth.
Vitamin cũng là yếu tố cần thiết, có ảnh hƣởng lớn đến quá trình nhân chồi in vitro ở thực vật, trong đó có vitamin B1 [13]. Trong nghiên cứu này, vitamin B1 ở các nồng độ khác nhau đƣợc sử dụng để đánh giá ảnh hƣởng đến quá trình nhân chồi Hoắc hƣơng in vitro. Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng vitamin B1 đến sự nhân chồi in
vitro của cây Hoắc hƣơng (sau 4 tuần)
Công thức Vitamin B1(ml/l) HSN (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá (lá) Hình thái chồi ĐC 0 2,41±0,3 2,28± 0,23 3,56± 0,22 Chồi xanh, mọng nƣớc CT1 0,5 2,51±0,15 2,88±0,14 3,56±0,15 Chồi xanh, mọng nƣớc
CT2 0,7 2,54±0,19 2,92±0,11 3,78±0,15 Chồi xanh khỏe
CT3 1,0 2,9±0,10 3,23±0,25 4,33±0,26 Chồi xanh mập khỏe
CT4 1,5 2,7±0,16 2,94±0,21 3,56±0,16 Chồi xanh khỏe
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng vitamin B1 đến hệ số nhân chồi in vitro của cây Hoắc hƣơng (sau 4 tuần)
Chồi/ Mẫu
Kết quả bảng 3.8 cho thấy vitamin B1 ở nồng độ khác nhau có ảnh hƣởng khác nhau đến sinh trƣởng, phát triển và hình thái chồi, thể hiện qua hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá/chồi và hình thái.
Hệ số nhân chồi ở các công thức ĐC, CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lƣợt bằng 2,41; 2,51; 2,54; 2,9 và 2,7. Trong đó, chỉ có hệ số nhân chồi ở công thức CT3 (bổ sung 1,0 mg/l B1) có hệ số nhân chồi cao hơn ở công thức ĐC và ở các công thức bổ sung B1 ở nồng độ khác.
Tuy nhiên, tất cả các nồng độ B1 nghiên cứu đều có tác dụng làm tăng chiều cao chồi so với ĐC. Chiều cao chồi ở các công thức CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lƣợt bằng 2,88; 2,92; 3,23 và 2,94 cm. Trong khi đó, chiều cao chồi ở công thức ĐC chỉ đạt 2,28 cm.
Với chỉ tiêu số lá/chồi, chỉ ở nồng độ 1 mg/l, vitamin B1 mới có tác dụng làm tăng số lá/chồi so với ĐC. Thực vậy, số lá/chồi ở công thức CT3 đạt 4,33 lá/chồi, cao hơn so với công thức ĐC và các công thức có bổ sung vitamin B1 ở các nồng độ còn lại.
Hình thái chồi ở công thức CT1 giống với ở ĐC, chồi màu xanh, mọng nƣớc. Trong khi đó, ở công thức CT2 và CT4, chồi có màu xanh, khỏe. Nhƣ vậy ở hai nồng độ 0,7 và 1,5 mg/l, vitamin B1 đã có tác động cải thiện chất lƣợng chồi. Đặc biệt ở nồng độ 1 mg/l, vitamin B1 có tác động tích cực nhất tới hình thái chồi. Chồi ở công thức CT3 có màu xanh, mập và khỏe.
Kết quả nghiên cứu này ủng hộ kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của vitamin B1 đối với quá trình nhân chồi in vitro cây chuối [41], hoặc ở cây Tetra (Prunus empyrean) [51].
Nhƣ vậy, vitamin B1 ở nồng độ 1 mg/l thích hợp nhất so với các nồng độ nghiên cứu khác đối với quá trình nhân chồi Hoắc hƣơng in vitro.
Hình 3.20. Chồi cây hoắc hƣơng dƣới ảnh hƣởng của nồng độ Vitamin B1 khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy
3.3.4. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ và phát triển cây in vitro hoàn chỉnh của cây Hoắc hương Pogostemon cablin (Blanco) Benth.
Cây nuôi cấy mô trƣớc khi chuyển ra ngoài vƣờn ƣơm cần phải có bộ rễ hoàn chỉnh. Cây có bộ rễ khỏe mạnh sẽ dễ bám vào giá thể và có khả năng hút nƣớc tốt, có khả năng thích nghi với môi trƣờng ex vitro. Do đó nghiên cứu lựa chọn môi trƣờng ra rễ thích hợp là một bƣớc không thể thiếu trong quy trình nhân giống in vitro.
Trong nghiên cứu này, NAA ở các nồng độ 0; 0,3; 0,5; 0,7 và 1,0 mg/l đƣợc bổ sung vào môi trƣờng tạo rễ. Kết quả sau 4 tuần theo dõi đƣợc thể hiện trong bảng 3.9
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng NAA đến khả năng tạo rễ và phát triển cây Hoắc hƣơng (sau 4 tuần)
Công thức NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) Chiều cao cây (cm) Số lá/cây (lá) ĐC 0,0 45±2,24 2,2±0,17 0,3±0,01 5,12±0,21 4,52±0,23 CT1 0,3 86±3,15 3,8±0,19 0,7±0,02 5,33±0,14 4,81±0,26
Công thức NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ/cây (rễ) Chiều dài rễ (cm) Chiều cao cây (cm) Số lá/cây (lá) CT2 0,5 100 4,3±0,21 0,9±0,01 5,64±0,17 5,16±0,15 CT3 0,7 100 4,1±0,11 0,8±0,01 5,45±0,19 4,94±0,17 CT4 1,0 100 4,1±0,15 0,7±0,02 5,44±0,15 4,92±0,21
Kết quả bảng 3.9. cho thấy rằng NAA ở các nồng độ khác nhau có ảnh hƣởng khác nhau đến tỷ lệ ra rễ của cây Hoắc hƣơng in vitro. Tỷ lệ ra rễ ở công thức Đc chỉ đạt 45%. Trong khi đó, tỷ lệ ra rễ tăng lên 86% ở công thức CT1. Tỷ lệ ra rễ ở các công thức CT2, CT3 và CT4 đạt 100%.
Bên cạnh đó, các nồng độ NAA khác nhau cũng ảnh hƣởng đến số rễ/cây. Sau 4 tuần nuôi cấy, số rễ/cây ở công thức ĐC đạt 2,2, trong khi chỉ số này ở các công thức CT1, CT2, CT3 và CT4 lần lƣợt bằng 3,8; 4,3; 4,1 và 4,1. Số rễ/chồi ở các công thức CT2, CT3, CT4 tƣơng đƣơng nhau, cao hơn ở CT1. Đồng thời, số rễ/cây ở tất cả các công thức có bổ sung NAA đều cao hơn ở công thức ĐC.
NAA cũng hảnh hƣởng đến chiều dài rễ Hoắc hƣơng in vitro. Chiều dài rễ ở công thức ĐC chỉ đạt 0,3 cm, thấp hơn ở tất cả các công thức có bổ sung NAA. Chiều dài rễ đạt giá trị lớn nhất ở công thức bổ sung 0,5 mg/l NAA (0,9 cm), kế đến là ở công thức bổ sung 0,7 mg/l NAA (0,8 cm) và hai công thức có bổ sung 0,3 và 1 mg/l (cùng bằng 0,7 cm).
Chiều cao cây và số lá/cây ở công thức ĐC chỉ thấp hơn so với ở công thức CT3. Sự sai khác về hai chỉ tiêu trên giữa công thức ĐC và các công thức CT1, CT2 và CT4 không có ý nghĩa thống kê.
Kết quả của đề tài tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Kết và cộng sự (2014) trên loài Trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy). Các chồi Trà my hoa đỏ in vitro có 3 - 4 đốt và 5 - 6 lá đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng có sự thay đổi khác nhau của nồng độ NAA (0,1; 0,3; 0,5 và
0,7mg/l), kết quả sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy môi trƣờng WPM có bổ sung 0,5mg/l NAA là môi trƣờng thích hợp nhất cho sự tạo rễ (14 rễ/chồi) [11].
Nhƣ vậy, môi trƣờng bổ sung 0,5 mg/l NAA (CT2) có hiệu quả cao nhất đối với sự tạo rễ của cây Hoắc hƣơng in vitro.
H ình 3.21. Rễ cây hoắc hƣơng invitro (4 tuần) nuôi cấy trong môi trƣờng có NAA
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
- Cây hoắc hƣơng đƣợc trồng tại Phú Thọ có đầy đủ các đặc điểm hình thái về lá, thân và rễ của cây Hoắc hƣơng đã đƣợc miêu tả.
- Hom cành non là vật liệu thích hợp nhất đối với giâm hom Hoắc hƣơng, đồng thời, hiệu quả giâm hom trong mùa xuân cao hơn so với mùa đông.
- Cả bốn loại chất kích rễ thƣơng mại đều gây hiệu ứng ra rễ với tỉ lệ 100%. N3M và RP có hiệu ứng làm số lƣợng rễ cao nhất ở cành hom non, RP và RT lại có hiệu ứng làm số lƣợng rễ cao nhất ở hai loại cành hom non và