CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái
- Đặc điểm thực vật điển hình: Lá, thân, rễ. Mẫu vật nghiên cứu phân loại là rễ, thân, lá, hoa của loài Hoắc hƣơng, đƣợc thu thập và xử lý theo đúng quy trình kỹ thuật.
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp giâm hom
Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của tuổi sinh lí cành hom đến khả năng ra rễ của cây Hoắc hƣơng
- Sử dụng 3 loại cành hom từ các phần khác nhau của cành Hoắc hƣơng, mỗi hom hai chồi mắt cắt vát, không để vết cắt dập nát sử dụng chất kích thích rễ ở thí nghiệm 1.
CT1: Hom cành non CT2: Hom cành bánh tẻ CT3: Hom cành già
- Giá thể giâm hom là cát. Cát đƣợc làm sạch, sau đó đổ và các rãnh rãnh đất kích thƣớc 150×30×8 (cm) đã đƣợc chuẩn bị trên luống đất, sau đó tƣới nƣớc ẩm, giâm hom với khoảng cách 6×6 (cm).
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 hom. Các chỉ tiêu theo dõi gồm tỉ lệ ra rễ,
số lƣợng rễ và chiều dài rễ sau 2 tuần.
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của chất kích rễ thƣơng mại đến khả năng ra rễ của Hoắc hƣơng giâm hom
Các chất kích thích rễ thƣơng mại phổ biến có thể tìm thấy trên thị trƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này. Các công thức thí nghiệm gồm:
N3M: N3M 20g/l KR: King root 2g/l RP: Rooting power 3g/l RT: Rootone 4ml/l
- Giá thể giâm hom là cát. Cát đƣợc làm sạch, sau đó đổ và các rãnh rãnh đất kích thƣớc 150×30×8 (cm) đã đƣợc chuẩn bị trên luống đất, sau đó tƣới nƣớc ẩm, giâm hom với khoảng cách 6×6 (cm).
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 hom. Các chỉ tiêu theo dõi gồm tỉ lệ ra rễ, số lƣợng rễ và chiều dài rễ sau 2 tuần.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến khả năng ra rễ của Hoắc hƣơng giâm hom
- IAA với các nồng độ 50ppm, 100ppm, 150ppm, 200ppm đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này, đối chứng sử dụng nƣớc cất. Các công thức thí nghiệm gồm:
CT1: 50 ppm IAA CT2: 100 ppm IAA CT3: 150 ppm IAA CT4: 200 ppm IAA
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 hom. Các chỉ tiêu theo dõi gồm tỉ lệ ra rễ, số lƣợng rễ và chiều dài rễ sau 2 tuần.
cây con sau giâm hom
Sử dụng cây con đã ra rễ sinh trƣởng phát triển tốt trồng trong bầu chứa các giá thể khác nhau. Các công thức thí nghiệm gồm:
CT1: Đất phù sa : Phân chuồng hoai (1:1) CT2: Đất phù sa : Trấu hun tỉ lệ (1:1) CT3: Đất phù sa : Xơ dừa tỉ lệ (1:1) CT4: Đất : Cát tỉ lệ (1:1)
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 hom. Các chỉ tiêu theo dõi gồm chiều cao cây sau 2 tuần.
2.2.2.2. Phương pháp nhân giống in vitro
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trên môi trƣờng MS (Murashige - Skoog) cải tiến bổ sung 20 g/l đƣờng, 7 g/l argar,1mg/l PVP, 0.5g/l than hoạt tính và các chất kích thích sinh trƣởng với các nồng độ khác nhau. Mẫu nuôi cấy in
vitro đƣợc duy trì ở nhiệt độ 25 ± 20C, cƣờng độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux,
thời gian chiếu sáng 10 giờ/ ngày.
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của cytokinin đến nhân nhanh chồi in vitro
Cụm chồi sau khi tái sinh chuyển sang môi trƣờng MS cải tiến bổ sung BAP và Kinetin riêng rẽ và kết hợp để nhân nhanh chồi, tạo chồi cứng cáp chuẩn bị cho ra rễ CT0: MTCS CT1: MTCS + 0,5mg/l BAP CT5: MTCS + 0,5mg/l Ki CT2: MTCS + 1,0mg/l BAP CT6: MTCS + 1,0mg/l Ki CT3: MTCS + 1,5mg/l BAP CT7: MTCS + 1,5mg/l Ki CT4: MTCS + 2,0mg/l BAP CT8: MTCS + 2,0mg/l KI
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi về chiều cao chồi, hệ số nhân chồi và hình thái chồi.
Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của nồng độ nƣớc dừa đến sự nhân chồi in
vitro của cây hoắc hƣơng
ĐC: Không bổ sung nƣớc dừa CT1: MTCS + 50ml/l nƣớc dừa CT2: MTCS + 100ml/l nƣớc dừa CT3: MTCS + 150ml/l nƣớc dừa CT4: MTCS + 200ml/l nƣớc dừa
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi về chiều cao chồi, hệ số nhân chồi và hình thái chồi.
Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của hàm lƣợng vitamin B1 đến sự nhân chồi
in vitro của cây Hoắc hƣơng
ĐC: Không bổ sung vitamin B1 CT1: MTCS + 0,5mg/l vitamin B1 CT2: MTCS + 0,7mg/l vitamin B1 CT3: MTCS + 1,0mg/l vitamin B1 CT4: MTCS + 1,5 mg/l vitamin B1
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi về chiều cao chồi, hệ số nhân chồi và hình thái chồi.
Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng tạo tạo rễ cây in vitro.
Tách các chồi đơn từ cụm chồi cấy chuyển sang môi trƣờng MS cải tiến bổ sung NAA. Các công thức thí nghiệm gồm:
ĐC: Không bổ sung chất ĐHST CT1: 0.3mg/l NAA
CT2: 0.5mg/l NAA CT3: 0.7mg/l NAA
CT4: 1mg/l NAA
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 15 mẫu. Các chỉ tiêu theo dõi về chiều cao cây, số lá, tỉ lệ ra rễ, số rễ và chiều dài rễ.
2.2.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu
+ Hệ số nhân chồi: Đếm số chồi trong các bình nuôi cấy; + Số rễ: Đếm tất cả các rễ của cây.
+ Chiều dài rễ: Đo từ cổ rễ đến chóp rễ bằng thƣớc kĩ thuật; + Số lá trên chồi/cây: Đếm tất cả các lá thật có trên chồi/cây. + Tỷ lệ sống (%) = (Tổng số mẫu sống/tổng số mẫu cấy) x 100
+ Chiều cao cây (cm): Đo từ gốc chồi sát mặt đất đến vuốt lá cao nhất bằng thƣớc kĩ thuật;.
+ Đƣờng kính tán lá (cm): Đo theo 2 chiều vuông góc bằng thƣớc kĩ thuật, lấy giá trị trung bình.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu trên các nội dung đều đƣợc thu thập, ghi chép theo đúng phƣơng pháp của mỗi chỉ tiêu; Các số liệu thu thập, theo dõi đƣợc xử lý bằng chƣơng trình thống kê sinh học IRRISTAT và Excel.