Thuốc thử hiện màu được sử dụng là vanilin.
ii. Phương pháp sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 0,063 mm (230- 400 mesh) của hãng Merck, pha động là dung môi rửa giải, chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, n-
hexane/acetone, CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp.
Về nguyên lý của phương pháp sắc ký cột silica gel cũng tương tự phương pháp sắc ký lớp mỏng ở trên; chỉ khác là trong sắc ký cột silica gel dung môi được rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đỉnh cột đi xuống dưới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh rồi ra khỏi cột và hệ dung môi được lựa chọn từ TLC sẽ được tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ được rửa giải trước rồi đến chất có độ phân cực cao hơn.
2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc
2.3.2.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Tương tự như electron, các hạt nhân nguyên tử có spin. Sự quay của các phần tử tích điện này – sự tuần hoàn của điện tích – sinh ra momen từ dọc theo trục spin, do đó các hạt nhân này có tác dụng giống như một nam châm nhỏ. Một trong các hạt nhân như vậy được nói đến ở đây là proton, hạt nhân của nguyên tử hidro 1H.
Về nguyên tắc, ta đặt một chất nghiên cứu trong từ trường có cường độ không đổi cho bức xạ có tần số thay đổi đều đi qua chất,ở đó xảy ra sự hấp thụ bức xạ và quan sát thấy tín hiệu. Loại phổ thu được như vậy gọi là phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [9].
Cơ sở lý thuyết của phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân dựa trên tương tác của hạt nhân từ (1H, 13C, …) với từ trường ngoài [9].
Cộng hưởng từ hạt nhân được phát hiện bởi Pecxen,Bloc(Mĩ) và Roling(Anh) vào năm 1946,ứng dụng vào Hóa hữu cơ từ năm 1953. Từ đó đến nay ngày càng được phát triển và hoàn thiện. Nó là một công cụ đắc lực cho các nhà hóa học trong việc xác định cấu trúc phân tử. Nó không thay thê hẳn được cho phương pháp phổ hồng ngoại và phổ electron, nhưng nó cung cấp lượng thông tin nhiều hơn và chi tiết hơn. Nhờ áp dụng nam châm siêu dẫn, máy tính điện tử, kĩ thuật NMR xung và kĩ thuật NMR hai chiều, phương pháp NMR vừa trải qua một cuộc cách mạng và đạt được những thành tựu mà kĩ thuật công hưởng từ hạt nhân truyền thống trước đây không làm được. [3]
Hạt nhân nguyên tử gồm các proton và các notron. Số lượng tử spin của proton cũng như notron đều bằng ½. Tùy thuộc vào việc các spin của những hạt nucleon đó có cặp đôi hay không mà hạt nhân của nguyên tử có thể được đặc trưng bởi một số lượng tử spin hạt nhân I bằng không hoặc khác không. Nếu spin của tất cả các nucleon đều cặp đôi thì số lượng tử spin bằng không. Nếu ở hạt nhân có một spin không cặp đôi thì I= 1
2 , nếu có nhiều spin không cặp đôi thì I ≥ 1 [3].
Dung môi dùng trong NMR cần không được chứa những hạt nhân cho tín hiệu che lấp tín hiệu chính. Thí dụ đối với cộng hưởng từ proton thường sử dụng các dung môi như CCl4, CDCl3, CD3OD... Việc lựa chọn dung môi phải dựa vào tính tan của chất nghiên cứu [3].
i. Phổ cộng hưởng từ nhân proton (1H-NMR)
Số lượng tín hiệu (vạch phổ): Ứng với mỗi phân tử đã cho, các proton với cùng điều kiện xung quanh như nhau, tức là có cấu tạo hóa học như nhau, sẽ hấp thụ ở cùng cường độ từ trường như nhau; các proton có điều kiện khác
nhau, tức là có cấu tạo hóa học khác nhau, sẽ hấp thụ ở cùng cường độ từ trường khác nhau. Số lượng tín hiệu trong phổ NMR cho ta biết số lượng tập hợp proton tương đương, hay là bao nhiêu “loại” proton [9].
Vị trí vạch phổ: Đối với số lượng tín hiệu cho ta biết trong phân tử chứa bao nhiêu loại proton thì vị trí của vạch phổ cho ta biết chúng thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc 1,…Các loại proton khác nhau thì có môi trường electron bao quanh khác nhau và chính môi trường electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ [9].
Khi xét proton riêng biệt thì proton bị che chắn đỏi hỏi cường độ từ trường ngoài cao hơn và proton bị phản chắn đòi hỏi cường độ từ trường ngoài thấp hơn để tạo ra cường độ từ trường hiệu dụng riêng khi sự hấp thụ xảy ra. Sự che chắn hay phản chắn làm cho sự hấp thụ chuyển dịch về phía trường cao hay trường thấp trong phổ NMR được gọi là độ chuyển dịch hóa học.
Độ chuyển dịch hóa học được đánh giá thông qua hệ số ( = /0= Hz/MHz = 106 ppm), trong đó chất nội chuẩn TMS được gán = 0 ppm [14]: