2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tƣợng: một số chỉ tiêu về sinh lí, hóa sinh của cây chè (C. sinensis), dòng 3.25, có nguồn gốc từ Viện Khoa học Nông- Lâm nghiệp Miền núi phía Bắc.
Phạm vi: một số chỉ tiêu về sinh lí, hóa sinh của cây chè (C. sinensis)
Quá trình nghiên cứu, tiến hành các thí nghiệm trực tiếp đƣợc thực hiện tại trung tâm nghiên cứu Công nghệ sinh học, phòng thực hành Bộ môn Sinh học và bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự nhiên, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Thị xã Phú Thọ, tỉnh Phú Thọ.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá ảnh hƣởng của axit salicylic đến tính chịu hạn của cây chè thông qua phân tích một số chỉ tiêu sinh lý và hóa sinh của cây chè.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Bố trí thí nghiệm 2.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí bao gồm 4 công thức theo sơ đồ sau:
Công thức Điều kiện hạn Nồng độ SA ĐC 0 0 SA 0 0,1 mM H Hạn 0 H+SA Hạn 0,1 mM
Cây chè sử dụng ở đây là các cây chè con, đƣợc sản suất bằng biện pháp dâm cành với độ tuổi khoảng 8 tháng. Kích thƣớc trung bình có chiều cao từ 40- 45 cm, số lƣợng lá trên mỗi cây từ 10- 15 lá.
Mỗi công thức thí nghiệm gồm 20 cây. Các công thức đƣợc bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn.
Theo các công thức. Cây chè đƣợc xử lí SA bằng cách phun qua lá, mỗi ct đƣợc phun 30 ml dung dịch SA sao cho ƣớt đều cả mặt trên và dƣới của các lá, sau khi phun xong bắt đầu gây hạn. Cây đƣợc gây hạn bằng cách ngừng tƣới nƣớc. Sau 5 ngày, khi lớp đất mặt chuyển màu từ nâu sang xám trắng (tƣơng đƣơng độ ẩm đất khoảng 50%), thì thu mẫu về để phân tích các chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh.
2.3.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý hóa sinh
Phương pháp định lượng diệp lục bằng phương pháp quang phổ
- Cân khoảng 0,1g lá cây rồi nghiền trong cối xứ với 1ml axeton 80%. Sau khi lá đã đƣợc nghiền nhuyễn, thêm 4ml aceton 80% vào tiếp tục nghiền. Sau đó đổ dung dịch nghiền đƣợc sang ống đong, cho thêm axeton 80% vào tráng cối, rồi lại đổ vào ống đong đó làm sao cho đạt đƣợc đủ 10ml.
- Sau đó đổ dung dịch từ ống đong sang ống li tâm để li tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 5 phút.
- Sau khi li tâm đem dung dịch đo trên máy quang phổ ở các bƣớc sóng 663nm, 647nm và 470nm.
Nồng độ sắc tố quang hợp (mg/ml) đƣợc tính theo công thức: Ca = 12,7.E663 – 2,69.E645
Cb = 22,9.E645 – 4,68.E663
Ca+b = 8,02.E663 + 20,2.E645
Cx+c = (1000.E470 - 1,82.Ca - 85,02.Cb)/198
- Hàm lƣợng diệp lục (mg/g lá tƣơi) đƣợc tính theo công thức sau: A=
Trong đó:
C: Nồng độ diệp lục (mg/l). V: Thể tích dịch chiết (ml) P: Khối lƣợng mẫu (g)
Phương pháp xác định hoạt độ enzym catalase
- Cân khoảng 0,2g mẫu lá cây, sau đó bổ sung một ít CaCO3, đệm pH = 7 và cho vào cối sứ nghiền nhuyễn.
- Cho 10ml đệm pH = 7 vào cối, khuấy đều và đổ vào ống đong 100ml. Tráng lại cối bằng đệm pH = 7 hai lần và đổ vào ống đong.
- Dẫn đệm vào ống đong đến 40ml.
- Cho vào bình đựng có viết tên công thức mẫu . Lắc bằng máy lắc trong 20 phút. - Lọc bằng bông sau đó lọc bằng giấy lọc vào bình tam giác đã đƣợc viết tên công thức mẫu tƣơng ứng, sau đó thu đƣợc dịch chiết.
- Ở mỗi mẫu lấy 10ml dịch chiết enzym cho vào bình đối chứng, 10 ml dịch chiết cho vào bình thí nghiệm đã đƣợc ghi tên công thức.
+ Đối với bình đối chứng, đem đi đun cách thủy sôi trong vòng 6 phút. Sau đó để nguội. Tiếp tục cho vào bình đối chứng 10ml dung dịch H2O2 0,1 % rồi đƣa vào trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong vòng 20 phút. Sau đó đƣa ra ngoài, nhỏ vào 5ml dung dịch H2SO4 10% rồi chuẩn độ bằng KMnO4.
+ Đối với bình thí nghiệm, nhỏ vào bình 10ml dung dịch H2O2 0,1% rồi cho ngay vào tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 20 phút. Sau đó đƣa ra ngoài, nhỏ vào 5ml dung dịch H2SO4 10% rồi chuẩn độ bằng KMnO4.
Phương pháp xác định huỳnh quang diệp lục
Chỉ tiêu huỳnh quang diệp lục đƣợc xác định bằng máy Chlorophyll fluorometer OS – ADC (Anh). Máy có màn hình hiển thị dữ liệu, thân máy gọn nhẹ rất thuận lợi cho các điều kiện nghiên cứu khác nhau. Ánh sáng của máy đƣợc cung cấp bằng đèn halogel 35W, ánh sáng điều biến. Máy sử dụng đầu dò PIN photodiode với kính lọc 700 ~ 750nm. Hệ thống kẹp adaption clip cho phép
đo đƣợc nhiều mẫu cùng một lúc. Dùng adaption clip kẹp mẫu lá 10 phút trƣớc khi đo để cho các trung tâm phản ứng ở trạng thái “mở” hoàn toàn hay có nghĩa là toàn bộ chất nhận điện tử đầu tiên trong chuỗi vận chuyển điện tử quang hợp – Quinon A (QA) ở trạng thái oxi hóa.
Các tham số trên máy gồm: F0: huỳnh quang ổn định Fm: huỳnh quang cực đại Fvm: huỳnh quang biến đổi
Phương pháp xử lý liệu
Các số liệu đƣợc tính toán theo phƣơng pháp thống kê toán học. Quá trình xử lý đƣợc thực hiện trên máy vi tính theo chƣơng trình Excelvà đƣợc mô phỏng bởi các bảng và biểu đồ.
Các số liệu đƣợc tính toán theo phƣơng pháp phân tích thống kê toán học. Quá trình xử lý số liệu đƣợc thực hiện trên máy tính với ứng dụng Data Analysis của chƣơng trình Excel 5.0 và đƣợc mô phỏng bởi các bảng và biểu đồ. Dùng hàm thống kê để phân tích phƣơng sai số liệu với ba lần lặp.
Các phƣơng pháp thống kê toán học
Cho mẫu số liệu có kích thƣớc N là x1;x2;...;xN
+ Giá trị trung bình mẫu:
= =
+ Phƣơng sai (kí hiệu: 2
s ) của mẫu số liệu đƣợc tính bởi công thức:
N i i x x N s 1 2 2 1
+ Độ lệch chuẩn (kí hiệu: s) của mẫu số liệu là:
N i i x x N s 1 2 1
t = với n ≥ 30
t = với n < 30
Nếu t ≥ 0,05 (p ≤ 0,05): Sự khác biệt giữa 2 giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê.
Nếu t < 0,05 (p > 0,05): Sự khác biệt giữa 2 giá trị trung bình mẫu không có ý nghĩa thống kê.