Sử dụng bộ chƣng cất dung môi để chƣng cất phân đoạn các dung môi trƣớc khi sử dụng.
Hình 2.4. Bộ chưng cất dung môi
Hệ thống đèn UV CAMAG đƣợc sử dụng để hiện màu dƣới bƣớc sóng UV 254; 366 nm.
Hình 2.5. Máy soi UV
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp ngâm chiết
Nguyên tắc tổng quát trong chiết tách hợp chất ra khỏi mẫu cây mà ngƣời khảo sát cần dựa vào là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất thứ cấp có trong cây mà ngƣời khảo sát
mong muốn tách cô lập. Vì cấu trúc hóa học đa dạng của những hợp chất tự nhiên, với tính chất phân cực khác biệt, nên không thể có một quy trình tổng quát nào có thể áp dụng chung cho tất cả các nhóm. Chính vì vậy cần phải thu thập đầy đủ các tài liệu tham khảo liên quan trực tiếp đến cây trƣớc khi tiến hành thực nghiệm để chọn đƣợc quy trình phù hợp. Sau đó lựa chọn các dung môi phù hợp với độ phân cực tăng dần (n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, MeOH, …) để chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ đồng thời sử dụng kỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm. Sau khi lấy mẫu cây về đem rửa sạch, để khô nƣớc, thái nhỏ rồi đem phơi khô. Sau khi mẫu đã khô, đem mẫu ngâm lần lƣợt với các dung môi: n-hexane; CH2Cl2, EtOAc, MeOH. Mỗi lần ngâm trong 24h sẽ thu đƣợc dịch chiết, sau đó dung dịch chiết đƣợc lọc qua giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ thu đƣợc cao chiết. Sử dụng máy cô quay chân không ở nhiệt độ dƣới 50oC để thu hồi dung môi qua lọc và thu đƣợc cặn chiết tƣơng ứng. Không nên chƣng cất loại dung môi ở nhiệt độ cao vì các hợp chất thiên nhiên kém bền nhiệt sẽ bị phân hủy [7].
2.3.2 Phương pháp sắc ký 2.3.2.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng A, B: Các vệt chất đƣợc phân tách Hình 2.6. Minh hoạt sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng, chủ yếu dựa vào khả năng hấp phụ khác nhau của các chất trên silica gel (pha tĩnh) sẽ đƣợc dung môi
rửa giải (pha động) khi đi lên theo lực mao quản sẽ phân tách (giải hấp) ở các vị trí khác nhau trên đƣờng đi của dung môi. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đi lên nhanh hơn chất có độ phân cực cao hơn [7].
Sắc ký lớp mỏng có ƣu điểm: Sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích, quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau [7]. Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần và sắc ký lớp mỏng điều chế đều đƣợc thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 có độ dày 0,25 mm của hãng Merck. Sau đó sử dụng dung môi để triển khai là 1 hoặc hỗn hợp một số dung môi thông dụng nhƣ n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, Acetone, MeOH, EtOH. Ceri sulfate là hóa chất đƣợc sử dụng làm thuốc thử hiện màu.
Độ linh động của chất đƣợc đánh giá thông qua hệ số Rf.
Nếu Rf(A) ≠ Rf(B) thì hai chất A, B đƣợc coi là tách riêng khỏi nhau khi triển khai sắc ký TLC. Từ hệ dung môi khi khảo sát TLC làm cơ sở để lựa chọn hệ dung môi cho sắc ký cột silica gel.
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký cột
Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi
đo trên cùng đƣờng đi của vật
R
Hình 2.7. Minh họa sắc ký cột
Nguyên lý của phƣơng pháp sắc ký cột silica gel cũng tƣơng tự phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng. Sắc ký cột là loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, đƣợc đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dƣới có gắn một khóa, dụng cụ này giống nhƣ buret để định phân trong phòng thí nghiệm. Pha tĩnh rắn đƣợc nhồi vào ống trụ. Mẫu cần tách đƣợc đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi đƣợc liên tục rót vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi di chuyển từ trên đầu cột xuống dƣới cột, xuyên ngang qua pha tĩnh, rồi ra khỏi cột và đƣợc hứng trong những ống nghiệm, mỗi ống nghiệm một thể tích nhƣ nhau. Nhờ thiết bị thu nhận mẫu tự động có thể hoạt động trong một thời gian dài, ngƣời ta có thể triển khai sắc ký cột để tự động qua đêm rất thuận tiện [7]. Hệ dung môi đƣợc lựa chọn từ TLC sẽ đƣợc tăng dần độ phân cực hoặc có thể chỉ là một dung môi duy nhất. Chất có độ phân cực kém hơn sẽ đƣợc rửa giải trƣớc rồi đến chất có độ phân cực cao hơn. Kích cỡ của cột sắc ký tùy thuộc vào lƣợng mẫu chất cần phân tích.
Sắc ký cột thƣờng, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-230 mesh astm) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi nhƣ CH2Cl2/n-hexane, EtOAc/n-hexane, acetone/n-hexane, MeOH/CH2Cl2,…với tỉ lệ thích hợp [7].
2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên
2.3.3.1 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Hạt nhân của nguyên tử 1H và một số nguyên tử khác cũng có số khối lẻ nhƣ 13
C, 19F ..., đều có momen từ. Nếu đặt proton chẳng hạn trong từ trƣờng không đổi thì momen từ của nó có thể định hƣớng cùng chiều hay ngƣợc chiều với từ trƣờng [8]. Do đó cơ sở lý thuyết của phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân dựa trên tƣơng tác của hạt nhân từ (1
H, 13C, …) với từ trƣờng ngoài.
Phổ cộng hƣởng từ nhân proton (1
H-NMR):
- Số lƣợng tín hiệu (vạch phổ), vị trí vạch phổ (độ chuyển dịch hóa học,
H) xác nhận các loại proton khác nhau và môi trƣờng bao quanh mỗi proton trong phân tử.
- Vị trí của tín hiệu cho biết proton thuộc loại proton nào: thơm, béo, bậc một, bậc hai, bậc ba,… Các proton khác nhau này có các môi trƣờng electron bao quanh khác nhau, và chính môi trƣờng electron bao quanh xác định proton hấp thụ ở đâu trong miền phổ [9].
Trên phổ 1
H-NMR tín hiệu các proton đƣợc ghi nhận thông qua độ chuyển dịch hóa học. Độ dịch chuyển hóa học đƣợc xác định bằng quãng cách giữa tín hiệu của nhóm những tín hiệu của proton (hay hạt nhân) đƣợc khảo sát và tín hiệu của proton hay hạt nhân ở chất chuẩn. Chất chuẩn thƣờng dùng là TMS đƣợc gán = 0 ppm. Độ dịch chuyển hóa học của một số loại proton đƣợc trình bày trong Bảng 2.1 [8].
Bảng 2.1. Độ chuyển dịch hóa học của proton
Loại proton (ppm) Loại proton (ppm)
R-CH3 R-CH2-R R3CH R2C=CH2 0,8÷1,0 1,2÷1,4 1,4÷1,6 4,5÷6,5 Ar-H R-OH R-CH=O R-COOH 6,5÷8,5 0,5÷5,0 9÷10 10,5÷12 - Cƣờng độ tín hiệu cho biết số proton cùng loại.
- Để biết proton nào tƣơng tác với proton nào ngƣời ta dựa vào Sự tƣơng tác (tách vạch phổ) và hằng số tƣơng tác spin – spin (J).
+ Hằng số tƣơng tác spin – spin J: Một proton hoặc một nhóm proton có thể cho tín hiệu cộng hƣởng đặc trƣng chỉ có một vạch đơn (singlet) hoặc một nhóm nhiều vạch (multiplet). Quãng cách giữa các vạch kề nhau của một nhóm nhiều vạch đƣợc gọi là hằng số tƣơng tác spin – spin (J) với đơn vị Hz [8]. Hằng số tƣơng tác J cho biết một cách chính xác loại thông tin về cấu trúc phân tử. Hằng số J không phụ thuộc vào từ trƣờng cảm ứng. Giá trị hằng số J đƣợc đo bằng Hz luôn bằng nhau dù từ trƣờng ngoài thế nào. Độ lớn của hằng số tƣơng tác phụ thuộc vào mối liên quan cấu trúc giữa các proton có tƣơng tác [9].
+ Sự tách vạch phổ gây nên bởi sự tƣơng tác tƣơng tác J. Sự tách vạch phản ánh môi trƣờng bao quanh của các proton đang hấp thụ không phải đối với các electron mà đối với các proton khác ở gần bên cạnh. Số vạch phổ đƣợc tách theo qui tắc n+1 với n là số proton có tƣơng tác. Cƣờng độ các vạch phổ đƣợc tách tỉ lệ theo qui tắc tam giác Pascal. Hình 2.8 minh họa về sự tách vạch phổ. Hình 2.8. Ví dụ minh họa về sự tách vạch phổ Bên cạnh phổ cộng hƣởng từ proton (phổ 1 H-NMR) ngƣời ta thƣờng áp dụng song song phổ cộng hƣởng từ 13C (phổ 13 C-NMR). Phổ 13C-NMR đƣợc sinh ra theo cách giống nhƣ phổ 1H-NMR [8], [9].
Đồng vị 13C chỉ chiếm 1,1% hàm lƣợng carbon thiên nhiên, nhƣng độ nhạy của phổ kế hiện đại đủ để đo phổ 13
C-NMR. Phổ 13
C-NMR cho nhiều loại thông tin nhƣ 1H-NMR những thông tin trực tiếp là về khung carbon mà không có proton gắn với nó [7].
- Số lƣợng tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu nhóm carbon khác nhau hay nhóm carbon tƣơng đƣơng khác nhau có ở trong phân tử.
- Sự tách vạch tín hiệu cho ta biết có bao nhiêu hiđro gắn với mỗi carbon. Phân biệt tín hiệu của carbon các bậc, nhóm CH là một vân đôi (d), ở nhóm CH2 là vân ba (t), ở nhóm CH3 là vân bốn (q), còn carbon không đính với hiđro là vân đơn (s). Trong kỹ thuật đo phổ hiện nay thƣờng khử tƣơng tác giữa C và H nên các carbon tƣơng đƣơng chỉ xuất hiện tín hiệu và 1 vạch đơn [9].
- Độ chuyển dịch hóa học (C) cho biết trạng thái lai hóa (sp3
, sp2,sp) của mỗi carbon, cho biết môi trƣờng electron bao quanh mỗi carbon đối với nhau, carbon gần bên cạnh hay các nhóm chức [9].
Thang độ chuyển dịch hóa học C-13 [20]