Bƣớc 3: Tiến hành rửa giải
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc/n-Hexane gradient (10- 100%).
Hứng dung dịch rửa giải khoảng 70-100 mL vào mỗi bình nón.
Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các bình có các vết chất tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng. Dội cột bằng dung môi EtOAc. Kết quả thu đƣợc 4 phân đoạn kí hiệu từ F1-F4 (Bảng 3.2).
Bảng 3.1. Kết quả các phân đoạn thu được từ cột tổng CH2Cl2
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân
đoạn Khối lƣợng (gam) 1 1÷5 500 mL EtOAc /n-Hexane 10:90 F1 1,42 2 6÷9 350 mL EtOAc /n-Hexane 10:90 F2 9,63 3 10÷27 1500 mL EtOAc/n-Hexane 10:90 F3 4,09
STT Bình gộp Dung môi rửa giải Phân đoạn Khối lƣợng (gam) 4 28÷63 1000 mL EtOAc /n-Hexane 10:90 2200 mL EtOAc /n-Hexane 20:80 400 mL EtOAc /n-Hexane 30:70 F4 5,42 5 Xả cột 500 mL EtOAc F5 15,74
Các phân đoạn F1-F4 đƣợc khảo sát lại TLC với các hệ dung môi EtOAc/n-Hexane (1:9) (I), EtOAc /n-Hexane (1:4) (II) cho kết quả nhƣ trong Hình 3.13.
(I) (II)
Hình 3.13. Hình ảnh TLC các phân đoạn F1÷F4
Bƣớc 4: Phân lập các chất từ các phân đoạn nh
Chọn phân đoạn F1 để tiến hành phân lập, sử dụng cột có đƣờng kính 2 cm, chiều dài 50 cm, đƣợc rửa sạch, tráng cột bằng acetone, sấy khô, lót dƣới đáy một ít bông. Chuẩn bị cột silica gel theo phƣơng pháp nhồi cột ƣớt. Cân 70 gam silica gel, ngâm trƣơng nở ngập trong n-hexane khoảng 40 phút, dùng đũa thủy tinh khuấy liên tục trong quá trình ngâm để đuổi hết bọt khí. Rót từ từ hỗn hợp silica gel đã trƣơng nở vào cột, vừa rót vừa vỗ nhẹ cột để đuổi hết bọt khí, để cột ổn định trong thời gian 4h. Lấy 1,42 gam cặn chiết CH2Cl2 (kí hiệu FPFD F1) đƣợc hòa với hỗn hợp CH2Cl2/n-Hexane vừa đủ cho tan hết,
rồi đem trộn với khoảng 2,8 gam silica gel, làm bay hơi hết dung môi trên máy quay cất chân không đến khi thu đƣợc hỗn hợp bột tơi màu vàng nhạt. Cho từ từ silica gel đã đính cặn vào cột, vừa cho vừa gõ nhẹ để phần silica gel phân bố đều vào cột (Hình 3.14.)
Hình 3.14. Cột silica gel FPFD F1
Tiến hành rửa giải bằng hệ dung môi EtOAc/n-Hexane 1%. Hứng dung dịch rửa giải khoảng 10 mL vào mỗi lọ hứng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành gộp các lọ có các vệt chết tƣơng đƣơng nhau trên bản mỏng. Dột cột bằng dung môi EtOAc thu đƣợc 3 phân đoạn kí hiệu F1.1-F1.3. Các phân đoạn F1.1-1.2 đƣợc khảo sát lại TLC cho kết quả nhƣ trong Hình 3.15.
Hình 3.15. Hình ảnh TLC các phân đoạn FPFDF1.1,1.2
Kết tinh phân đoạn FPFDF1.2 trong hệ dung môi CH2Cl2/n-Hexane 50:50 thu đƣợc 21 mg hợp chất FPFDC1 dƣới dạng chất rắn màu trắng.
Hình 3.16. Sơ đồ phân lập hợp chất FPFDC1
Hợp chất FPFDC1 không hiện màu dƣới đèn tử ngoại ở các bƣớc sóng
254, 366 nm và hiện màu với thuốc thử Ce(SO4)2 (Hình 3.17.)
3.3 Xác định cấu trúc hợp chất FPFDC1
Sau khi tiến hành ngâm chiết mẫu quả cây Trâu cổ, sắc kí silica gel nhiều lần kết hợp phƣơng pháp kết tinh đã phân lập đƣợc hợp chất FPFDC1.
Hợp chất FPFDC1 đƣợc đo phổ khối lƣợng, phổ cộng hƣởng từ hạt nhân tại
Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Từ những dữ kiện phổ thu đƣợc và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc của hợp chất FPFDC1 là một hợp chất triterpenoid -taraxerol acetate.
Hình 3.18. Cấu trúc hợp chất FPFDC1
Phổ khối lƣợng ESI-MS của FPFDC1 cho pic ion phân tử proton hóa
[M +H]+ = 469 và pic ion giả phân tử [M-CH3COOH+H]+ = 409 phù hợp với CTPT C32H52O2, M=468.
Phân tích phổ 13
C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 32 carbon trong đó có 9 nhóm methyl, 10 nhóm methylene, 5 nhóm methin, 1 nhóm carbonyl và 7 carbon bậc 4.
Hình 3.20. Phổ 13
Hình 3.22. Phổ 1
Trên phổ 1
H-NMR xuất hiện tín hiệu đặc trƣng của 8 nhóm methyl ở H
0,82 (s); 0,86 (s); 0,88 (s); 0,91 (s) (2 x CH3); 0,96 (s) (2 x CH3) ; 1,09 (s); 1 nhóm acetate (OCOCH3) ở H 2,04 và tín hiệu của proton nhóm methin olefinic ở H 5,53 (dd, J=8,0; 3,0 Hz, H-15). Bên cạnh đó trên phổ 1H-NMR còn có tín hiệu của 1 nhóm methin gắn với oxygen đã đƣợc acetyl hóa ở C-3 ở H 4,46 (dd, J=10,0; 5,0 Hz, H-3).
Hình 3.23. Phổ 1
Phân tích phổ 1
H-NMR kết hợp với phổ HSQC của FPFD1 cho thấy tín hiệu của nhóm methin sp3
liên kết với oxygen ở H 4,46 (dd, J=10,0; 5,0 Hz, H-3) tƣơng ứng với C 81,0 (C-3) trên phổ 13C-NMR. Liên kết đôi trong phân tử FPFD1 đƣợc khẳng định bởi tín hiệu của nhóm methin olefinic ở H 5,53 (dd, J=8,0; 3,0 Hz, H-15) và C 158,0 (C-14); 116,9 (C-15).
Phân tích phổ COSY xác định đƣợc các chuỗi liên kết H15-H16; H3- H2a-H1a; H5-H6b-H7a; H9-H11b-H12b; H21a-H22a.
Hình 3.25. Phổ COSY của FPFDC1
Trên phổ HMBC xác định đƣợc tƣơng tác giữa H-3 với C-23, C-24 và nhóm C=O ester chứng tỏ nhóm acetate liên kết với C-3 ; H-23 với C-4, C-24, C-5 chứng tỏ vị trí C-4 gắn với 2 nhóm CH3-23, 24. Các tƣơng tác chính trên phổ HMBC đƣợc trình bày trên hình 3.27.
Hình 3.27. Tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của FPFDC1
Từ các dữ liệu phổ ESI-MS, phổ 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY,, HSQC, HMBC và so sánh với tài liệu tham khảo [19] cho phép xác định cấu trúc của FPFDFC1 là -taraxerol acetate.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Kết quả của đề tài khóa luận tốt nghiệp đã đạt đƣợc mục tiêu đề ra:
- Điều chế đƣợc 40,3 gam cặn dịch chiết CH2Cl2 quả cây Trâu cổ và đã khảo sát sắc ký bản mỏng cặn dịch chiết này; lựa chọn đƣợc hệ dung môi EtOAc/n-hexane làm dung môi rửa giải trong sắc ký cột silica gel để phân tách cặn dịch chiết CH2Cl2 thành 5 phân đoạn khác nhau. Đã phân lập đƣợc hợp chất triterpenoid taraxerol acetate (FPFDC1) từ phân đoạn nhỏ của cặn chiết CH2Cl2 quả cây Trâu cổ bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel và kết tinh.
- Cấu trúc của hợp chất FPFDC1 đã đƣợc xác định bằng các phƣơng
pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 chiều, 2 chiều: 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và phổ khối lƣợng.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ các dịch chiết khác nhƣ MeOH, EtOAc của quả cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) nhằm tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có trong quả loài cây này.
- Khảo sát hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập đƣợc từ quả cây Trâu cổ.
- Bán tổng hợp một số hợp chất từ cây Trâu cổ và khảo sát hoạt tính sinh học của chúng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
[1]. Võ Văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng-Tập 1, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
[2]. Nguyễn Văn Hùng (2011), Họ Na (Annonaceae)-Hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Desmos rostrata, Goniothalamus tamirensis, Fissistigma villosissium - Quyển 1, NXB Khoa học Tự nhiên và Công
nghệ, Hà Nội.
[3]. Triệu Quý Hùng (2014), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài Goniothalamus macrocalyx Ban và Goniothalamus gracilipes Ban họ Na (Annonaceae), Luận án Tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa
học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.
[4]. Đỗ Tất Lợi (2011), Những cây cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB
Thời Đại.
[5]. Hoàng Hƣơng Ly (2018), Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất Triterpenoid từ cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm ( Moraceace),
Khóa luận tốt nghiệp ngành sƣ phạm hóa học, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phú Thọ.
[6]. Phạm Thị Oanh, Đỗ Thị Xuyến, Đỗ Văn Hài, Nguyễn Trung Thành (2017), “Ficus squamosa Roxb. (Họ Dâu tằm - Moraceae) đƣợc ghi nhận mới cho hệ thực vật Việt Nam”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 33(3), 94-97.
[7]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[8]. Trần Quốc Sơn, Đặng Văn Liếu (2013), Giáo tình cơ sở hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB Đai học sƣ phạm.
[9]. Đặng Nhƣ Tại, Ngô Thị Thuận (2010), Hóa học hữu cơ-Tập 1, NXB
[10]. Đào Thị Hải Yến (2017), Nghiên cứu thành phần hóa học một số phân
đoạn dịch chiết n-Hexane lá cây Trâu cổ (Ficus pumila L.) họ dâu tằm ( Moraceace) trên địa bàn tỉnh Phú Thọ, Khóa luận tốt nghiệp ngành sƣ
phạm hóa học, Trƣờng Đại học Hùng Vƣơng, Phú Thọ.
Tài liệu Tiếng Anh
[11]. Anshul Chawla, Ramandeep Kaur, Anil Kumar Sharma (2012), “ Ficus carica Linn.: A Review on its Pharmacognostic, Phytochemical and Pharmacological Aspects”, International Journal of Pharmaceutical and Phytopharmacological Research, 1(4), pp215-232.
[12]. Junichi KITAJIMA, Kaoru KIMIZUKA, Masanobu ARAI and Yasuko TANAKA (1998), “Constituents of Ficus pumila Leaves”, Chem. Pharm. Bull. 46(10), 1647-1649.
[13]. Junichi KITAJIMA, Kaoru KIMIZUKA, and Yasuko TANAKA (1999), “New Dammarane-Type Acetylated Triterpenoids and Their Related Compounds of Ficus pumila Fruit”, Chem. Pharm. Bull. 47(8),
1138-1140.
[14]. SHUKRANUL MAWA & IKRAM M. SAID (2012), Chemical Constituents of Garcinia prainiana. Sains Malaysiana, 41(5), pp585–
590.
[15]. Shukranul Mawa, Ibrahim Jantan and Khairana Husain (2016), “Isolation of Terpenoids from the Stem of Ficus aurantiaca Griff and
their Effects on Reactive Oxygen Species Production and Chemotactic
Activity of Neutrophils”, Molecules, 21, 9;
doi:10.3390/molecules21010009.
[16]. Consolacion Y. Ragasa, Agnes B. Alimboyoguen, and Chien-Chang Shen (2014), “Chemical constituents of Ficus nota”, Der Pharma Chemica, 6(4), 98-101.
[17]. Pham Thi Nhat Trinh, Nguyen Huu An, Pham Ngoc An, Mai Dinh Tri, Cao Van Du, Nguyen Thi Le Thuy, Nguyen Trong Tuan, Vang Thi
Kim Thoa, Nguyen Ngoc Tuan & Le Tien Dung (2017), “A new benzofuran derivative from the leaves of Ficus pumila L.”, Natural Product Research, DOI: 10.1080/14786419.2017.1395427.
[18]. Virgilio D. Ebajo Jr, Robert Brkljača, Sylvia Urban, Consolacion Y. Ragasa (2015), “Chemical Constituents of Hoya buotii Kloppenb”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, Vol. 5(11), pp 069-072.
[19]. Trinh Thi Thuy, Tran Van Sung, Katrin Frank and Ludger Wessjohann (2008). Triterpenes from the roots of Codonopsis pilosula. Journal of Chemistry, 46(4), 515-520.
[20]. https://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/orgpage/nmr.htm [21]. http://www.magritek.com/wp-content/uploads/2014/05/009-Propyl-
NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN
Trong quá trình thực hiện Khóa luận tốt nghiệp, sinh viên Nguyễn Hạnh Ngân đạt đƣợc các nội dung sau:
1. Về tinh thần, thái độ làm việc của sinh viên:
- Có tinh thần làm việc nghiêm túc, tích cực học hỏi, bố trí thời gian thực hiện các thực nghiệm khoa học.
- Tích cực và chủ động học hỏi, tìm đọc các tài liệu liên quan đến đề tài Khóa luận tốt nghiệp
2. Những kết quả đạt được của KLTN:
Kết quả đề tài khóa luận tốt nghiệp đạt mục tiêu đề ra:
- Điều chế đƣợc 40,3 gam cặn dịch chiết CH2Cl2 quả cây Trâu cổ. Đã phân lập đƣợc hợp chất triterpenoid taraxerol acetate (FPFDC1) từ phân đoạn nhỏ của
cặn chiết CH2Cl2 quả cây Trâu cổ bằng phƣơng pháp sắc ký cột silica gel và kết tinh.
- Xác định cấu trúc của hợp chất FPFDC1 bằng các phƣơng pháp phổ cộng
hƣởng từ hạt nhân 1 chiều, 2 chiều: 1
H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và phổ khối lƣợng.
GIẢNG VIÊN HƢỚNG DẪN
TS. Triệu Quý Hùng
SINH VIÊN THỰC HIỆN