CHƢƠNG 2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
a) Phản ứng thủy phân
Phản ứng thủy phân thay thế nhóm alkoxide (–OR) trong liên kết kim loại alkoxide bằng nhóm hydroxyl (–OH) để tạo thành liên kết kim loại hydroxyl.
Theo phương trình phản ứng sau rút gọn sau
R‟-Si(OR)3-x (OH)x + H2O R-Si(OR)2-x(OH)x+1 + ROH Trong đó x là 0, 1 và 2
Các thông số ảnh huởng chủ yếu đến quá trình thủy phân là pH, bản chất và nồng độ của chất xúc tác, nhiệt độ, dung môi, tỉ số H2O/ precusor.
b) Phản ứng ngƣng tụ
Phản ứng ngưng tụ cũng xảy ra theo cơ chế thế nucleophine lưỡng phân tử SN2 xảy ra hoặc do sự loại ra một phân tử nuớc do phản ứng giữa hai nhóm silanol hoặc do loại ra một phân tử rượu do phản ứng giữa nhóm silanol và nhóm alk oxit. Giai đoạn ngưng tụ này nhằm tạo ra cầu liên kết siloxane (≡ Si-O-Si ≡), đó
là một đơn vị cơ bản của polyme vô cơ.
2.3.2.Phƣơng pháp micelle
Micelle là hệ gồm 3 thành phần: chất hoạt động bề mặt, nuớc và dung môi. Trong đó, chất hoạt động bề mặt là chất mà phân tử có hai đầu gồm một đầu kỵ nuớc và một đầu ưa nuớc. Do dó, tùy thuộc vào pha của hệ là nhiều nuớc hay nhiều dung môi mà sẽ hình thành các hệ micelle thuận hay đảo.
2.4.Phƣơng pháp phân tích
2.4.1.Phân tích cấu trúc bằng phổ nhiễu xạ tia X
Khi chiếu chùm tia X tới, tia X bị tán xạ trên các nút mạng theo mọi phương, hai tia tán xạ song song có thể giao thoa với nhau và tạo thành các cực đại và cực tiểu nhiễu xạ. Vì vậy, theo các phương ta đều có hiện tuợng nhiễu xạ ánh sáng, tuy nhiên chỉ theo phương phản xạ gương (phương có góc phản xạ bằng góc tới) mới quan sát đuợc hiện tuợng nhiễu xạ vì theo phương đó cuờng độ nhiễu xạ lớn. Phương pháp phân tích cấu trúc tinh thể và pha bằng nhiễu xạ tia X dựa trên hiện tượng nhiễu xạ tia X bởi mạng tinh thể khi thỏa mãn điều kiện phản xạ Bragg:
2dsinƟ = n.λ (2.1)
Trong đó Ɵ là góc phản xạ, λ là buớc sóng tia X, n là bậc nhiễu xạ.
Hình 2.5 Hiện tượng các tia X nhiễu xạ trên các mặc tinh thể chất rắn.
Qua phổ XRD chúng ta xác định được cấu trúc vật liệu, và các tạp chất không mong muốn, định tính được các chất trong mẫu nghiên cứu.
Sản phẩm sau khi tổng hợp xong được đo nhiễu xạ tia X bằng máy Siemens Diffrak tometer Viện Vật Lý Việt Nam.
2.4.2.Máy đo phổ hấp thụ hồng ngoại
Phổ hấp thụ là đường biểu diễn sự phụ thuộc của hệ số hấp thụ của môi trường vật vào bước sóng của ánh sáng tới. Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có cường độ I0 song song vào một môi truờng vật chất có bề dày l (cm) và nồng độ C (mol/l), chùm tia này sẽ bị môi trường hấp thụ, tán xạ hoặc truyền qua. Cường độ I của chùm tia truyền qua môi trường này bị giảm theo quy luật theo biểu thức toán học của định luật Beer-Lamber sau:
ln (I0/I) = Kn (2.2)
hay: ln (I0/I) = ɛlC Trong dó: K- là hệ số hấp thụ
n- số mol chất nghiên cứu đặt trên đuờng đi của bức xạ
Đại lượng ln (I0/I) gọi là mật độ quang (D) hay độ hấp thụ (A), ɛ là hệ số hấp thụ mol. Sản phẩm sau khi tổng hợp được tiến hành đo tại phòng thí nghiệm Vật liệu kĩ thuật cao, F.17, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Tp. Hồ Chí Minh.
2.4.3.Từ kế mẫu rung
Từ kế mẫu rung (Vibrating Specimen Magnetometer – VSM) thường được dùng để đo lường tính chất từ của vật liệu như một hàm của từ trường, nhiệt độ và thời gian. VSM thì dựa trên sự dao động của mẫu trong từ trường để tạo ra một mômen từ xoay chiều trong hệ có đầu dò thích hợp .
Từ kế mẫu rung hoạt động theo nguyên tắc cảm ứng điện từ, sức điện động sinh ra bởi mẫu sắt từ khi chúng dao động với tần số không đổi, dưới sự có mặt của từ trường không đổi và đồng nhất.
2.4.4.Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscope) là một công cụ thiết yếu để phân tích một cách trực quan các vật liệu nanô. TEM có khả năng quan sát các cấu trúc và hình dạng của mẫu.
Mẫu phân tích là mẫu lỏng, được phủ lên trên lưới đồng, nanô kim loại sẽ bám vào bề mặt lưới và đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM-1400, Nhật (Phòng Thí nghiệm trọng điểm Quốc Gia Vật liệu Polymer và Composite, ĐH Bách Khoa, Tp.HCM). Sau khi tinh chỉnh máy để đạt được ảnh TEM của hạt nanô kim loại rõ nét nhất, các ảnh TEM sẽ được chụp và gửi dữ liệu đến máy tính dưới dạng file ảnh.
2.4.5.Đo mật độ quang
Đo mật độ quang (Optical Density-OD) là phương pháp dùng để đo nồng độ tế bào có trong dung dịch huyền phù. Phương pháp này có ưu điểm lớn là có thể thực hiện trong thời gian ngắn và không gây phá hủy tế bào.
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên hiện tượng tán xạ ánh sáng: Khi truyền qua dung dịch huyền phù, ánh sáng sẽ bị tán xạ. Sự tán xạ phụ thuộc vào nồng độ tế bào trong dung dịch huyền phù. Nồng độ tế bào càng cao thì sự tán xạ càng lớn.
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1.Hóa chất và dụng cụ 3.1.Hóa chất và dụng cụ
Trong phần thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng các hóa chất sau đây:
Bảng 3.1. Danh mục các hóa chất STT Hóa chất Công STT Hóa chất Công thứcphân tử Hãng sản xuất Trọng lƣợng phân tử (g/mol) Độ tinh khiết
1 Sắt (II) clorua FeCl2.4H2O Merck M =198.81 99.5% 2 Sắt (III) clorua FeCl3.6H2O Merck M =198.81 99.0% 3 Natri hidroxit NaOH Merck M = 39.9971 96.0%
4 Ethanol C2H5OH Merck M = 46.07 99.8%
5 Tetraethyl orthosilicate Si(OC2H5)4 Merck M=208.33 98.5% 6 1,1‟- Carbonyldiimidazole C7H6N4O Aldrich, Sigma M=162.15 90.0% 7 Amoniac – 25% wt NH3 Trung Quốc M=17.03 25-8%
8 Acid sulfuric H2SO4 Merck M=98.08 95-8%
9 Hydrogen Peroxide H2O2 Trung
Quốc M=34.01 30% 10 3-Glycidyloxypropyl trimethoxysilane C9H20O5Si Merck M=236.34 98.0% 11 Triethylamine C6H5N Trung Quốc M=101.19 12 Toluen C6H5CH3 Merck M=92.14
13 Natri clorua NaCl Merck M=58.44 99.0%
14 1,1‟- Carbonyldiimidazole C7H6N4O Aldrich, Sigma M=162.15 97.0% 15 Acetolnitrile CH3CN Meck M=201.23 99.9%
Ngoài ra còn có một số hóa chất được chuẩn bị tại PTN CNSH phân tử và môi trường thuộc khoa Sinh học như: dung dịch đệm PBS, protein BSA,…
Các dụng cụ thí nghiệm: máy khuấy từ, máy khuấy cơ, máy siêu âm, lò nung, lọ thuỷ tinh, cá từ, cân điện tử, lọ sứ, cối – chày sứ, kẹp gắp, muỗng nhỏ, ống sinh hàn, bình khí Argon, lọ thuỷ tinh, đũa khuấy, giấy cân, micropipette, ống bảo quản, tủ đông, nam châm vĩnh cửu.
3.2.Các quy trình thực nghiệm
3.2.1. Quy trình tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 trong hệ kín
Quy trình tạo hạt nanô ôxít sắt trong hệ kín khí Argon [2] được tóm tắt bằng sơ đồ hình 3.1 sau:
Siêu âm
Hình 3.1 . Quy trình tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4.
Để có được mẫu tốt nhất, tôi đã khảo sát việc tổng hợp nhiều mẫu hạt từ Fe3O4 và các mẫu đều được sấy chân không ở các nhiệt độ 50°C, 70°C sau đó khảo sát các tính chất của hạt để chọn mẫu tốt nhất thực hiện bước tiếp theo.
Thu hạt bằng nam châm Rửa với nƣớc cất và EtOH Sấy khô trong chân không ở
50oC/ 15h
FeCl3..6H2O Nước cất FeCl2.4H2O Nước cất
Dd FeCl2 Dd FeCl3 Hỗn hợp Fe2+, Fe 3+ NaOH 25% Dung dịch có chứa hạt kết tủa
3.2.2. Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4
Để khảo sát phân tán hạt nanô ôxít sắt từ , chúng tôi khảo sát xử lý bề mặt hạt bằng HNO3, axit oleic và trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA.
Tiến hành chụp TEM để chọn ra phương pháp tối ưu cho quá trình chức năng hóa bề mặt.
a) Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng HNO3
Lấy 100 mg hạt nanô ôxít sắt từ phân tán trong 100 ml dung dịch HNO3 đánh siêu âm 4 giờ ở nhiệt độ phòng.
Hạt phân tán được rửa ly tâm với nước cất năm lần để loại bỏ tạp chất còn dư. Để khảo sát việc phân tán của hạt nanô ôxít sắt chụp ảnh TEM.
Hình 3.2. Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng HNO3.
b) Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA
Lấy 500 mg hạt nanô ôxít sắt từ phân tán siêu âm trong 20 ml nước cất, 10 ml axit oleic siêu âm 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Để khảo sát việc phân tán của hạt nanô ôxít sắt chụp ảnh TEM.
Hình 3.3. Quy trình xử lý hạt Fe3O4 bằng OA.
c) Quy trình tổng hợp và xử lý trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA
Cho hỗn hợp muối sắt gồm 3,1736 g FeCl
2.4H
2O (0,016 mol) và 8,656 g FeCl
3.6H
2O (0,032 mol) vào bình cầu ba cổ có chứa 320 ml nước khử ion. Đánh siêu âm hỗn hợp trong 30 phút, đồng thời nâng nhiệt độ lên 50°C và sục khí Argon. Khuấy trong 1 giờ sau đó cho tiếp 40 ml dung dịch NaOH vào. Khi đó, hỗn hợp dung dịch sẽ chuyển màu dần dần từ cam sang nâu và cuối cùng là đen. Tiếp tục khuấy và duy trì nhiệt độ trong 30 phút nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn và cho 3 ml axit oleic vào phản ứng và đánh siêu âm trong vòng 1 giờ. Khí Argon được sục liên tục vào dung dịch trong suốt quá trình phản ứng.
Hạt nanô Fe3O4 thu được bằng cách lọc rửa nhiều lần với nước khử ion và lắng bằng nam châm vĩnh cửu. Cuối cùng, sản phẩm lắng đọng được đem sấy chân không ở 50°C trong 15 giờ.
Hình 3.4. Quy trình tổng hợp và xử lý trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA.
3.2.3. Quy trình bao bọc hạt nanô Fe3O4 bằng SiO2
Hình 3.6. Mô hình của hạt Fe3O4 xử lý OA được phủ lớp SiO2 (lớp màu cam).
Kích thước hạt nanô ôxít sắt được bao bọc SiO2 hay bề dày của lớp vỏ SiO2 có thể điều khiển bằng cách thay đổi tỉ lệ khối lượng hạt sắt trên thể tích nước, tỉ lệ thể tích giữa nước với thể tích TEOS và NH3 [2]. Tuy nhiên trong giới hạn về thời gian luận văn này chúng tôi chưa khảo sát điều đó.
3.2.4. Quy trình xử lý bề mặt Fe3O4@SiO2 bằng piranha
Cho 100 mg hạt Fe3O4 được xử lý bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2SO4 và H2O2 theo tỉ lệ 7:3) đánh siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hạt nanô Fe3O4 thu được bằng cách lọc rửa ly tâm 5 lần với nước khử ion. Cuối cùng, sản phẩm lắng đọng được đem sấy chân không ở 80°C trong 9 giờ.
3.2.5. Quy trình gắn kết GPS lên bề mặt Fe3O4@SiO2 đã xử lý
γ-glycidoxypropyltrimethoxy silane (GPS) mà một hợp chất thuộc họ silane. Có cấu trúc chung là: X-R-Si(OR’)3
Trong đó X:các nhóm chức hữu cơ (Amino, Vinyl, Alkyl…) R‟: các nhóm methyl, ethyl, isopropyl…
R: Aryl hoặc Alkyl (CH2)n với n = 0, 1 hoặc 3.
Ở đề tài này, chúng tôi lựa chọn GPS với mục đích cố gắng làm giảm lực đẩy giữa các liên kết trên bề mặt hạt từ phủ SiO2 và làm cho bề mặt trở nên đồng đều hơn. Cơ chế gắn của GPS cũng tương tự như phủ SiO2 lên hạt nanô Fe3O4 nhưng trước đó bề mặt của hạt từ phủ SiO2 đã được xử lý bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2SO4 và H2O2 theo tỉ lệ 7:3).
Sau khi đã xử lý với piranha, hạt nanô Fe3O4 đã phủ SiO2 sẽ được đặt trong dung dịch có chứa 1% GPS và 0,2% TEA (triethylamine) trong toluene và siêu âm gia nhiệt tới 70oC trong vòng 8 giờ. Sau đó tiếp tục siêu âm ở nhiệt độ phòng 12 giờ và tiếp tục ở 70oC thêm 8 giờ nữa.
GPS gắn lên Fe3O4@SiO2 theo phương trình :
Hình 3.9. Quy trình gắn kết GPS trên bề mặt Fe3O4@SiO2 đã xử lý.
3.2.6. Giải vòng epoxy trên GPS
GPS trong môi trường nước có chứa NaCl và HCl sẽ xảy ra phản ứng mở vòng epoxy để tạo thành diol. Trong trường hợp này, HCl đóng vai trò là một xúc tác làm cho H+ sẽ proton hóa vào nguyên tử O của vòng epoxy, C kề O sẽ càng thiếu điện tử, tạo điều kiện cho tâm thân hạch tấn công dễ dàng hơn. Từ đó bề mặt hạt nanô sẽ là:
Hình 3.10. Mô hình của mẫu M3_SG đã giải vòng epoxy.
Sự thủy phân này được thực hiện bằng cách ngâm hạt đã gắn GPS trong 100 ml dung dịch NaCl 0.1 M có bổ sung vài giọt HCl cho tới pH = 4. Hỗn hợp trên được siêu âm trong vòng 30 phút ở 70°C.
Hình 3.11. Quy trình thủy phân vòng epoxy cho hạt Fe3O4@SiO2/GPS.
3.2.7. Cố định CDI lên hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O
Hạt từ sau khi gắn thành công GPS và đã giải vòng epoxy tiếp tục được ngâm trong dung dịch gồm 1-50 mg CDI trong 1ml acetonitrile (Đối với khoảng 1 mg hạt). Sau đó sẽ được siêu âm ở nhiệt đô phòng trong vòng một giờ.
Cơ chế gắn của CDI:
Hình 3.13. Cơ chế gắn của CDI.
3.2.8. Quy trình gắn kết protein BSA lên mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O và mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI
Tham khảo một số bài báo nghiên cứu cho thấy rằng họ đã thành công trong việc sử dụng hạt nanô sắt từ để gắn kết với các protein khác nhau như albumin hoặc với các tế bào CD4, CD8T... Kết quả cho thấy khả năng, mức độ gắn kết của hạt nanô ôxít sắt từ với protein là khá tốt, từ đó dễ dàng thực hiện các bước phân tách sau này [11,16]. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát khả năng gắn kết của hạt nanô Fe3O4@SiO2/GPS-O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI với protein BSA từ đó làm rõ hơn vai trò của CDI trong chức năng hóa bề mặt hạt nanô ôxít sắt.
Đầu tiên chúng tôi loại bỏ dung môi actone ra khỏi mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS- O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI. Sau đó chúng tôi lần lượt hòa tan mỗi mẫu hạt nanô ôxít sắt này vào dung dịch đệm BSA để tạo thành dung dịch A1 và A2 đều có nồng độ 10 mg/ml. Bên cạnh đó, chúng tôi chuẩn bị hỗn hợp gồm protein BSA và dung dịch đệm PBS để tạo thành dung dịch B với nồng độ 300µg/ml như đã nêu trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Thành phần các dung dịch để tiến hành phản ứng với protein BSA. Mẫu Phân Mẫu Phân loại Thành phần Nồng độ Dung dịch A A1 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O + 1ml PBS 10mg hạt/ml A2 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI + 1ml PBS 10mg hạt/ml Dung dịch B 300µg BSA + 1ml PBS 300µg/ml
Hình 3.14. Quy trình gắn kết protein BSA.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Ở phần thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp và hoạt hóa bề mặt các hạt nanô ôxít sắt từ để thu được những “hạt nanô từ sinh học” với những đặc tính mong muốn, thích hợp cho việc gắn albumin. Trong phần này, chúng tôi sẽ khảo sát các đặc tính của các hạt nanô ôxít sắt từ sinh học bằng các phương pháp: phân tích liên kết qua phổ hồng ngoại hấp thụ (FT-IR), khảo sát cấu trúc hạt với máy nhiễu xạ tia X (XRD), khảo sát tính chất từ bằng máy đo từ kế mẫu rung (VSM) và cuối cùng kích thước và hình thái hạt sẽ được phân tích nhờ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Trong quá trình phân tích phổ, số liệu được xử lí bằng phần mềm Origin 8.5.1.
4.1.Tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4
4.1.1. Khảo sát hạt nanô ôxít sắt theo nhiệt độ khác nhau
Từ cơ sở lý thuyết tổng quan cùng với sự kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 theo quy trình ở hình 3.1 trong môi trường khí Argon.
Trong quá trình tạo hạt, tỉ lệ Fe2+: Fe3+ được giữ không đổi. Tiến hành khảo sát nhiệt độ sấy hạt nanô ôxít sắt ở nhiệt độ 50°C và 70°C.