3.2.7. Cố định CDI lên hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O
Hạt từ sau khi gắn thành công GPS và đã giải vòng epoxy tiếp tục được ngâm trong dung dịch gồm 1-50 mg CDI trong 1ml acetonitrile (Đối với khoảng 1 mg hạt). Sau đó sẽ được siêu âm ở nhiệt đô phòng trong vòng một giờ.
Cơ chế gắn của CDI:
Hình 3.13. Cơ chế gắn của CDI.
3.2.8. Quy trình gắn kết protein BSA lên mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O và mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI
Tham khảo một số bài báo nghiên cứu cho thấy rằng họ đã thành công trong việc sử dụng hạt nanô sắt từ để gắn kết với các protein khác nhau như albumin hoặc với các tế bào CD4, CD8T... Kết quả cho thấy khả năng, mức độ gắn kết của hạt nanô ôxít sắt từ với protein là khá tốt, từ đó dễ dàng thực hiện các bước phân tách sau này [11,16]. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát khả năng gắn kết của hạt nanô Fe3O4@SiO2/GPS-O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI với protein BSA từ đó làm rõ hơn vai trò của CDI trong chức năng hóa bề mặt hạt nanô ôxít sắt.
Đầu tiên chúng tôi loại bỏ dung môi actone ra khỏi mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS- O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI. Sau đó chúng tôi lần lượt hòa tan mỗi mẫu hạt nanô ôxít sắt này vào dung dịch đệm BSA để tạo thành dung dịch A1 và A2 đều có nồng độ 10 mg/ml. Bên cạnh đó, chúng tôi chuẩn bị hỗn hợp gồm protein BSA và dung dịch đệm PBS để tạo thành dung dịch B với nồng độ 300µg/ml như đã nêu trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Thành phần các dung dịch để tiến hành phản ứng với protein BSA. Mẫu Phân Mẫu Phân loại Thành phần Nồng độ Dung dịch A A1 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O + 1ml PBS 10mg hạt/ml A2 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI + 1ml PBS 10mg hạt/ml Dung dịch B 300µg BSA + 1ml PBS 300µg/ml
Hình 3.14. Quy trình gắn kết protein BSA.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Ở phần thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp và hoạt hóa bề mặt các hạt nanô ôxít sắt từ để thu được những “hạt nanô từ sinh học” với những đặc tính mong muốn, thích hợp cho việc gắn albumin. Trong phần này, chúng tôi sẽ khảo sát các đặc tính của các hạt nanô ôxít sắt từ sinh học bằng các phương pháp: phân tích liên kết qua phổ hồng ngoại hấp thụ (FT-IR), khảo sát cấu trúc hạt với máy nhiễu xạ tia X (XRD), khảo sát tính chất từ bằng máy đo từ kế mẫu rung (VSM) và cuối cùng kích thước và hình thái hạt sẽ được phân tích nhờ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Trong quá trình phân tích phổ, số liệu được xử lí bằng phần mềm Origin 8.5.1.
4.1.Tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4
4.1.1. Khảo sát hạt nanô ôxít sắt theo nhiệt độ khác nhau
Từ cơ sở lý thuyết tổng quan cùng với sự kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 theo quy trình ở hình 3.1 trong môi trường khí Argon.
Trong quá trình tạo hạt, tỉ lệ Fe2+: Fe3+ được giữ không đổi. Tiến hành khảo sát nhiệt độ sấy hạt nanô ôxít sắt ở nhiệt độ 50°C và 70°C.
Bảng 4.1. hảo sát hạt trần ôxít sắt tạo được sấy ở các nhiệt độ khác nhau
Mẫu Nhiệt độ tạo hạt (o C)
Nhiệt độ sấy(o C) Chân không Không khí
M1 50°C 50°C 50°C
M2 50°C 70°C 70°C
Hình 2.4.Bể siêu âm UltrasonicLC60H.
Dưới đây là một số kết quả đo FT-IR và XRD:
Hình 4.1. Giản đồ nhiễu xạ XRD của các mẫu oxit sắt sau khi tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa.
Giản đồ nhiễu xạ XRD của mẫu M1-50°C và M2-300°C (hình 4.1) biểu hiện những peak đặc trưng của tinh thể cấu trúc tetragonal với sự hiện diện của các đỉnh tại vị trí góc 2θ là 30.4°; 35.5°; 37.2°; 43.6°; 53.4°; 57,2°; 63,1° tương ứng với các mặt mạng (220), (311), (222), (400), (422), (511), (440). Kết quả này giống với kết quả được tham khảo từ bài báo.
Hình 4.2 là giản đồ nhiễu xạ tia X chuẩn các ôxít sắt. Từ các giản đồ nhiễu xạ chúng ta nhận thấy các đỉnh nhiễu xạ của vật liệu Fe3O4 và γ-Fe2O3 khá giống nhau về vị trí và cường độ tương đối. Các đỉnh nhiễu xạ của γ-Fe2O3 hơi dịch về phía có góc nhiễu xạ lớn hơn so với Fe3O4, một vài đỉnh khác biệt có cường độ nhỏ rất khó xác định đối với các giản đồ nhiễu xạ không thực sự sắc nét. Từ phương trình Scherrer, chúng tôi tính được kích thước tinh thể tương ứng mặt mạng (311) là khoảng 13 nm.
Hình 4.2. Giản đồ nhiễu xạ XRD của các mẫu oxit sắt Fe3O4 và γ-Fe2O3
a) Phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR
Đối với hệ kín, chúng tôi khảo sát quá trình chuyển pha của hạt trần Fe3O4 theo nhiệt độ sấy, cụ thể là theo bốn điều kiện như sau: sấy khô hạt trần ở 50°C, 70°C trong không khí và chân không. Sau khi sấy hạt trần Fe3O4 ở bốn điều kiện trên ta thấy màu sắc của chúng rất khó phân biệt như được trình bày ở hình 4.3.
Hình 4.3. Màu sắc của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín và sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C, 70°C trong chân không và ngoài không khí.
Đem 4 mẫu trên đi đo phổ FT-IR thu được kết quả:
Hình 4.4. Phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín và sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C, 70°C trong chân không và ngoài không khí.
Hình 4.4trình bày kết quả đo phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín và sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C, 70°C trong chân không và ngoài không khí (50 CK, 70 CK: sấy khô 50°C, 70°C trong chân không; 50 KK, 70 KK: sấy khô 50°C, 70°C trong không khí). Kết quả cho thấy chỉ có phổ của mẫu hạt trần Fe3O4 được sấy khô ở 70°C trong điều kiện có không khí cho thấy các dao động đặc trưng Fe-O lần lượt xuất hiện tại các vùng có số sóng 727, 696, 634, 588, 480 cm- 1(tương ứng với số thứ tự ( ), (2), (3), (4), (5) được kí hiệu trên hình). So sánh với phổ FT-IR của γ-Fe2O3 chứng tỏ mẫu hạt trần Fe3O4 được sấy khô ở 70°C trong điều kiện có không khí đã tồn tại pha γ-Fe2O3.
Từ kết quả đo trên chúng tôi có thể kết luận rằng mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín, sau khi sấy khô ở 70°C trong không khí thì dần chuyển sang pha γ-Fe2O3.
Hình 4.5. So sánh phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 và γ-Fe2O3
b) Phân tích dạng hình học và kích thƣớc của hạt nanô ôxít sắt từ
Hình 4.7. Ảnh TEM hạt trần Fe3O4 ở nhiệt độ phòng.
Dựa vào kết quả chụp TEM ở hình 4.6 ta có thể nhận thấy rằng kích thước hạt trần Fe3O4 khá đồng đều và kích thước hạt trung bình nhỏ hơn 20 nm.
Trên ảnh chụp TEM hình 4.7 là hạt trần Fe3O4 được tổng hợp trong hệ kín ở nhiệt độ phòng, ta thấy kích thước của chúng không đồng đều và sự phân tán chưa tốt. Do đó, chúng tôi không chọn điều kiện nhiệt độ phòng để tổng hợp hạt trần Fe3O4. Bên cạnh đó, dựa vào tài liệu tham khảo, kích thước hạt nhỏ nhất ở 50°C, vì vậy điều kiện nhiệt độ này được chúng tôi chọn để đưa vào quy trình tổng hợp hạt trần Fe3O4.
4.1.2. Khảo sát hạt nanô ôxít sắt siêu âm và khuấy cơ a) Phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR a) Phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR
Với mục tiêu là tạo ra hạt nanô ôxít sắt có kích thước hạt nhỏ hơn 20 nm và độ từ hóa cực đại lớn, chúng tôi chọn đối tượng tổng hợp là hạt nanô ôxít sắt có pha Magnetite – Fe3O4. Từ cơ sở lý thuyết tổng quan và kế thừa kết quả trước đây của nhóm nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nanô ôxít sắt theo quy trình ở hình 3.1 với sự thay đổi siêu âm và khuấy cơ được trình bày ở bảng 4.2, nhiệt độ giữ ở 50°C lần lượt trong môi trường khí Argon. Hạt sau kết tủa sẽ được sấy khô trong môi trường chân không ở 50°C.
Hình 4.8. Phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tạo bằng siêu âm và khuấy cơ. và khuấy cơ.
Bảng 4.2. hảo sát hạt nanô ôxít sắt siêu âm và khuấy cơ. Mẫu FeCl 2.4H 2O FeCl 3.6H 2O Nhiệt độ(°C) Sử dụng Siêu âm Khuấy cơ
M1 3.1736g 7.5684g 50°C 600
M2 3.1736g 7.5684g 50°C
Trên kết quả FTIR hình 4.8 là hạt trần Fe3O4 được tổng hợp trong hệ kín ở vẫn giữ pha tinh thể không có sự chuyển sang pha γ-Fe2O3. Do đó, chúng tôi phân tích dạng hình học và kích thước của hạt nanô ôxít sắt từ để chọn phương pháp tốt nhất vào quy trình tổng hợp hạt trần Fe3O4.
b) Phân tích dạng hình học và kích thƣớc của hạt nanô ôxít sắt từ.
Hình 4.9. Ảnh TEM hạt nanô ôxít sắt bằng siêu âm (bên trái) và khuấy cơ (bên phải).
Dựa vào kết quả chụp TEM ở hình 4.9, ta có thể nhận thấy rằng mẫu siêu âm cho kết quả hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 tròn và đồng đều kích thước trung bình nhỏ hơn 20 nm.
So sánh kết quả chụp TEM với kết quả tính kích thước hạt bằng công thức Scherrer từ phổ XRD của mẫu ở 50o
C, chúng tôi thấy kết quả này tương đối phù hợp với nhau .
Từ những kết quả trên, chúng tôi đã tổng hợp thành công bột sắt từ Fe3O4 có tính chất siêu thuận từ, với kích thước hạt nhỏ hơn 20 nm. Do vậy, chúng tôi chọn phương pháp siêu âm và ở nhiệt độ 50o
C môi trường chân không trong quá trình tạo hạt cho các bước khảo sát tiếp theo.
4.2.Xử lý hạt nanô ôxít sắt Fe3O4
Nhằm mục đích giảm kết tụ, tăng độ phân tán, kích thước hạt đồng đều hơn và đặc biệt là hình thành nhóm –OH hoặc –CH2 để liên kết với lớp chức năng tiếp theo, tức là lớp vỏ SiO2, nên chúng tôi đã chọn HNO3 và OA để xử lý hạt Fe3O4 . Tuy nhiên, theo tham khảo kết quả của một số bài báo nghiên cứu [12] chúng tôi thấy rằng quá trình tổng hợp và xử lý bằng OA trực tiếp sẽ tiết kiệm thời gian và tiết kiệm hóa chất hơn. Vậy bài khóa luận này chúng tôi tiến khảo sát ba quá trình xử lý hạt Fe3O4 theo như bảng :
Bảng 4.3. Các điều kiện xử lý hạt Fe3O4 của 3 mẫu M1, M2 và M3.
Tên mẫu Xử lý
Điều kiện phản ứng Điều kiện sấy Nhiệt độ Môi trường Nhiệt độ Môi trường
M1 HNO3 30°C Không khí 50°C Chân không M2 OA 30°C Không khí M3 OA trực tiếp 50°C Argon
Các mẫu sau khi xử lý xong sẽ được đo phổ FT-IR nhằm xác nhận các dao động đặc trưng của mẫu bột. Để đo phổ FT-IR, chúng tôi lấy 0.001 g bột mẫu cần đo trộn với 0.100 g KBr, sau đó ép thành viên tròn bằng máy ép trong phòng thí nghiệm Vật Liệu Kĩ Thuật Cao, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, lực ép F = 350 kg/cm2. Và kết quả nhận được thể hiện theo hình 4.10.
Hình 4.10. ết quả FT-IR của các mẫu M1, M2, M3 và dung dịch OA tinh khiết.
Bảng 4.4. Các dao động đặc trưng của M1, M2, M3 và dung dịch OA.
Từ kết quả FT-IR trên cho thấy cả ba mẫu M1, M2 và M3 đều xuất hiện duy nhất dao động Fe-O đặc trưng cho pha magnetite Fe3O4 tại vùng có số sóng 579 cm-1. Riêng đối với mẫu M2 và M3, có xuất hiện dao động CH2 thuộc loại bất đối xứng tại số sóng 2861 cm-1 và 2932 cm-1 còn mẫu M1 thì không, ngoài ra còn xuất hiện tại dao động bất đối xứng –COO tại vùng phổ có số sóng 1438 cm-1
điều này có nghĩa là đầu cacboxyl của phân tử OA đã bám dính lên bề mặt hạt nanô Fe3O4. Từ những nhận định trên chúng tôi kết luận rằng cả ba mẫu M1, M2 và M3 đều là ôxít sắt Fe3O4, M2 và M3 đều có tồn tại của OA.
Số sóng (cm-1) 579 937/1462 1283 1438 1634 1708 2861 2932 Dao động (Fe-O) (-OH) (C-O) as (COO–) δ (-OH) (C=O) s (CH2) as (CH2)
Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành chụp ảnh TEM của cả ba mẫu M1, M2 và M3 nhằm dự đoán kích thước hạt và kiểm tra độ phân tán của chúng. Từ kết quả ảnh TEM của ba mẫu M1, M2 và M3 ở thang đo 100 nm cho ta nhận xét rằng: Mẫu M1 (xử lý bằng HNO3) chưa phân tán tốt, mẫu hạt còn kết tụ thành đám. Điều này có thể lý giải rằng việc xử lý bằng HNO3 đối với hạt nanô Fe3O4 áp dụng chưa được tốt bởi Fe3O4 có từ tính mạnh.
Hình 4.11. ết quả ảnh TEM của các mẫu M1, M2, M3.
Tiếp theo, so sánh mẫu M2 và M3 ta thấy rằng không có gì khác biệt nhiều nhưng phương pháp mẫu M3 có ưu điểm tiết kiệm thời gian và hóa chất hơn. Nên chúng tôi chọn mẫu M3 tiếp tục kiểm tra pha tinh thể thông qua giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD).
Giản đồ nhiễu xạ XRD của mẫu Fe3O4 và Fe3O4-OA (M3) hình 4.12 đều biểu hiện những dao động đặc trưng của tinh thể cấu trúc lập phương spinel đảo với sự hiện diện của các đỉnh tại vị trí góc 2θ là 29.9°; 35.5°; 43.1°; 53.6°; 57.2°; 62.6° tương ứng với các mặt mạng (220), (311), (400), (422), (511), (440). Kết quả này giống với kết quả được tham khảo từ bài báo khoa học. Từ cơ sở này, chúng tôi kết luận rằng quá trình xử lý OA trực tiếp trong giai đoạn tồng hợp hạt không làm thay đổi cấu trúc tinh thể, mẫu bột màu đen mà chúng tôi tạo thành được đặt tên M3 là các hạt nanô magnetite.
Dựa vào giản đồ XRD của mẫu M3 và áp dụng công thức Scherrer để tính kích thước tinh thể :
(4.1)
Trong đó:
D: kích thước hạt
: bước sóng của tia X, = 1.54056 Aº.
(2 ) : độ bán rộng của vạch nhiễu xạ.
Kết quả tính kích thước hạt M3 bằng công thức Scherrer từ giản đồ XRD là 13 nm. Vậy kết quả tính được này đúng với kết quả dự đoán từ ảnh TEM.
Tiếp tục, chúng tôi cũng tiến hành kiểm chứng tính chất từ của mẫu M3 thông qua phép phân tích đường cong từ hóa của nó. Kết quả đo đạc đường cong từ hóa của mẫu M3 được thể hiện qua bảng 4.5 và hình 4.13.
Bảng 4.5. ết quả đường cong từ hóa của M3.
Mẫu Độ từ hóa cực đại Mmax (emu/g) Độ từ dƣ Mr (emu/g) Độ kháng từ Hc (Oe) Mr/Mmax M3 69.753 5.933 54.95 0.085
Dữ liệu từ tính của mẫu M3 ở bảng 4.5 cho kết quả mẫu hạt M3 có tính siêu thuận từ với tỉ lệ Mr /Mmax thấp 0.085 và độ từ hóa cực đại là 69.753 emu/g có khả năng ứng dụng trong y-sinh học cũng như ứng dụng phân tách tế bào.
Hình 4.13. Phổ VSM của mẫu Fe3O4 (M3).
Qua các kết quả phân tích trên, có thể kết luận rằng mẫu M3 mà chúng tôi tạo được đang ở pha tinh thể magnetic - Fe3O4 với kích thước hạt trung bình 13 nm, hạt tròn và đồng đều và độ từ hóa bão hòa 69.753emu/g (con số này có thể đã giảm so với thực tế do mẫu đã bao lớp axít ôlêic), hạt có tính siêu thuận từ có thể ứng dụng trong y sinh học.
Bước đầu có kết quả khả quan do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành bọc SiO2 lên mẫu M3 nhằm bảo vệ hạt nanô ôxít sắt và sản phẩm được đặt tên là M3_S.
4.3.Bao phủ hạt nanô ôxít sắt bằng lớp vỏ SiO2
4.3.1. Khảo sát bao phủ hạt nanô ôxít sắt từ theo thời gian
Sau khi tiến hành bao phủ hạt nanô ôxít sắt bằng lớp vỏ SiO2 theo thời gian 2 giờ, 4 giờ, 8 giờ chúng tôi tiến hành các phép phân tích FT-IR, từ kế mẫu rung và