CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM
3.2. Các quy trình thực nghiệm
3.2.2. Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4
Để khảo sát phân tán hạt nanô ôxít sắt từ , chúng tôi khảo sát xử lý bề mặt hạt bằng HNO3, axit oleic và trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA.
Tiến hành chụp TEM để chọn ra phương pháp tối ưu cho quá trình chức năng hóa bề mặt.
a) Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng HNO3
Lấy 100 mg hạt nanô ôxít sắt từ phân tán trong 100 ml dung dịch HNO3 đánh siêu âm 4 giờ ở nhiệt độ phòng.
Hạt phân tán được rửa ly tâm với nước cất năm lần để loại bỏ tạp chất còn dư. Để khảo sát việc phân tán của hạt nanô ôxít sắt chụp ảnh TEM.
Hình 3.2. Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng HNO3.
b) Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA
Lấy 500 mg hạt nanô ôxít sắt từ phân tán siêu âm trong 20 ml nước cất, 10 ml axit oleic siêu âm 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Để khảo sát việc phân tán của hạt nanô ôxít sắt chụp ảnh TEM.
Hình 3.3. Quy trình xử lý hạt Fe3O4 bằng OA.
c) Quy trình tổng hợp và xử lý trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA
Cho hỗn hợp muối sắt gồm 3,1736 g FeCl
2.4H
2O (0,016 mol) và 8,656 g FeCl
3.6H
2O (0,032 mol) vào bình cầu ba cổ có chứa 320 ml nước khử ion. Đánh siêu âm hỗn hợp trong 30 phút, đồng thời nâng nhiệt độ lên 50°C và sục khí Argon. Khuấy trong 1 giờ sau đó cho tiếp 40 ml dung dịch NaOH vào. Khi đó, hỗn hợp dung dịch sẽ chuyển màu dần dần từ cam sang nâu và cuối cùng là đen. Tiếp tục khuấy và duy trì nhiệt độ trong 30 phút nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn và cho 3 ml axit oleic vào phản ứng và đánh siêu âm trong vòng 1 giờ. Khí Argon được sục liên tục vào dung dịch trong suốt quá trình phản ứng.
Hạt nanô Fe3O4 thu được bằng cách lọc rửa nhiều lần với nước khử ion và lắng bằng nam châm vĩnh cửu. Cuối cùng, sản phẩm lắng đọng được đem sấy chân không ở 50°C trong 15 giờ.
Hình 3.4. Quy trình tổng hợp và xử lý trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA.
3.2.3. Quy trình bao bọc hạt nanô Fe3O4 bằng SiO2
Hình 3.6. Mô hình của hạt Fe3O4 xử lý OA được phủ lớp SiO2 (lớp màu cam).
Kích thước hạt nanô ôxít sắt được bao bọc SiO2 hay bề dày của lớp vỏ SiO2 có thể điều khiển bằng cách thay đổi tỉ lệ khối lượng hạt sắt trên thể tích nước, tỉ lệ thể tích giữa nước với thể tích TEOS và NH3 [2]. Tuy nhiên trong giới hạn về thời gian luận văn này chúng tôi chưa khảo sát điều đó.
3.2.4. Quy trình xử lý bề mặt Fe3O4@SiO2 bằng piranha
Cho 100 mg hạt Fe3O4 được xử lý bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2SO4 và H2O2 theo tỉ lệ 7:3) đánh siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hạt nanô Fe3O4 thu được bằng cách lọc rửa ly tâm 5 lần với nước khử ion. Cuối cùng, sản phẩm lắng đọng được đem sấy chân không ở 80°C trong 9 giờ.
3.2.5. Quy trình gắn kết GPS lên bề mặt Fe3O4@SiO2 đã xử lý
γ-glycidoxypropyltrimethoxy silane (GPS) mà một hợp chất thuộc họ silane. Có cấu trúc chung là: X-R-Si(OR’)3
Trong đó X:các nhóm chức hữu cơ (Amino, Vinyl, Alkyl…) R‟: các nhóm methyl, ethyl, isopropyl…
R: Aryl hoặc Alkyl (CH2)n với n = 0, 1 hoặc 3.
Ở đề tài này, chúng tôi lựa chọn GPS với mục đích cố gắng làm giảm lực đẩy giữa các liên kết trên bề mặt hạt từ phủ SiO2 và làm cho bề mặt trở nên đồng đều hơn. Cơ chế gắn của GPS cũng tương tự như phủ SiO2 lên hạt nanô Fe3O4 nhưng trước đó bề mặt của hạt từ phủ SiO2 đã được xử lý bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2SO4 và H2O2 theo tỉ lệ 7:3).
Sau khi đã xử lý với piranha, hạt nanô Fe3O4 đã phủ SiO2 sẽ được đặt trong dung dịch có chứa 1% GPS và 0,2% TEA (triethylamine) trong toluene và siêu âm gia nhiệt tới 70oC trong vòng 8 giờ. Sau đó tiếp tục siêu âm ở nhiệt độ phòng 12 giờ và tiếp tục ở 70oC thêm 8 giờ nữa.
GPS gắn lên Fe3O4@SiO2 theo phương trình :
Hình 3.9. Quy trình gắn kết GPS trên bề mặt Fe3O4@SiO2 đã xử lý.
3.2.6. Giải vòng epoxy trên GPS
GPS trong môi trường nước có chứa NaCl và HCl sẽ xảy ra phản ứng mở vòng epoxy để tạo thành diol. Trong trường hợp này, HCl đóng vai trò là một xúc tác làm cho H+ sẽ proton hóa vào nguyên tử O của vòng epoxy, C kề O sẽ càng thiếu điện tử, tạo điều kiện cho tâm thân hạch tấn công dễ dàng hơn. Từ đó bề mặt hạt nanô sẽ là:
Hình 3.10. Mô hình của mẫu M3_SG đã giải vòng epoxy.
Sự thủy phân này được thực hiện bằng cách ngâm hạt đã gắn GPS trong 100 ml dung dịch NaCl 0.1 M có bổ sung vài giọt HCl cho tới pH = 4. Hỗn hợp trên được siêu âm trong vòng 30 phút ở 70°C.
Hình 3.11. Quy trình thủy phân vòng epoxy cho hạt Fe3O4@SiO2/GPS.
3.2.7. Cố định CDI lên hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O
Hạt từ sau khi gắn thành công GPS và đã giải vòng epoxy tiếp tục được ngâm trong dung dịch gồm 1-50 mg CDI trong 1ml acetonitrile (Đối với khoảng 1 mg hạt). Sau đó sẽ được siêu âm ở nhiệt đô phòng trong vòng một giờ.
Cơ chế gắn của CDI:
Hình 3.13. Cơ chế gắn của CDI.
3.2.8. Quy trình gắn kết protein BSA lên mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O và mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI
Tham khảo một số bài báo nghiên cứu cho thấy rằng họ đã thành công trong việc sử dụng hạt nanô sắt từ để gắn kết với các protein khác nhau như albumin hoặc với các tế bào CD4, CD8T... Kết quả cho thấy khả năng, mức độ gắn kết của hạt nanô ôxít sắt từ với protein là khá tốt, từ đó dễ dàng thực hiện các bước phân tách sau này [11,16]. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát khả năng gắn kết của hạt nanô Fe3O4@SiO2/GPS-O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI với protein BSA từ đó làm rõ hơn vai trò của CDI trong chức năng hóa bề mặt hạt nanô ôxít sắt.
Đầu tiên chúng tôi loại bỏ dung môi actone ra khỏi mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS- O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI. Sau đó chúng tôi lần lượt hòa tan mỗi mẫu hạt nanô ôxít sắt này vào dung dịch đệm BSA để tạo thành dung dịch A1 và A2 đều có nồng độ 10 mg/ml. Bên cạnh đó, chúng tôi chuẩn bị hỗn hợp gồm protein BSA và dung dịch đệm PBS để tạo thành dung dịch B với nồng độ 300µg/ml như đã nêu trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Thành phần các dung dịch để tiến hành phản ứng với protein BSA. Mẫu Phân Mẫu Phân loại Thành phần Nồng độ Dung dịch A A1 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O + 1ml PBS 10mg hạt/ml A2 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI + 1ml PBS 10mg hạt/ml Dung dịch B 300µg BSA + 1ml PBS 300µg/ml
Hình 3.14. Quy trình gắn kết protein BSA.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Ở phần thực nghiệm, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp và hoạt hóa bề mặt các hạt nanô ôxít sắt từ để thu được những “hạt nanô từ sinh học” với những đặc tính mong muốn, thích hợp cho việc gắn albumin. Trong phần này, chúng tôi sẽ khảo sát các đặc tính của các hạt nanô ôxít sắt từ sinh học bằng các phương pháp: phân tích liên kết qua phổ hồng ngoại hấp thụ (FT-IR), khảo sát cấu trúc hạt với máy nhiễu xạ tia X (XRD), khảo sát tính chất từ bằng máy đo từ kế mẫu rung (VSM) và cuối cùng kích thước và hình thái hạt sẽ được phân tích nhờ kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Trong quá trình phân tích phổ, số liệu được xử lí bằng phần mềm Origin 8.5.1.
4.1.Tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4
4.1.1. Khảo sát hạt nanô ôxít sắt theo nhiệt độ khác nhau
Từ cơ sở lý thuyết tổng quan cùng với sự kế thừa các kết quả nghiên cứu trước đây của nhóm nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 theo quy trình ở hình 3.1 trong môi trường khí Argon.
Trong quá trình tạo hạt, tỉ lệ Fe2+: Fe3+ được giữ không đổi. Tiến hành khảo sát nhiệt độ sấy hạt nanô ôxít sắt ở nhiệt độ 50°C và 70°C.
Bảng 4.1. hảo sát hạt trần ôxít sắt tạo được sấy ở các nhiệt độ khác nhau
Mẫu Nhiệt độ tạo hạt (o C)
Nhiệt độ sấy(o C) Chân không Không khí
M1 50°C 50°C 50°C
M2 50°C 70°C 70°C
Hình 2.4.Bể siêu âm UltrasonicLC60H.
Dưới đây là một số kết quả đo FT-IR và XRD:
Hình 4.1. Giản đồ nhiễu xạ XRD của các mẫu oxit sắt sau khi tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa.
Giản đồ nhiễu xạ XRD của mẫu M1-50°C và M2-300°C (hình 4.1) biểu hiện những peak đặc trưng của tinh thể cấu trúc tetragonal với sự hiện diện của các đỉnh tại vị trí góc 2θ là 30.4°; 35.5°; 37.2°; 43.6°; 53.4°; 57,2°; 63,1° tương ứng với các mặt mạng (220), (311), (222), (400), (422), (511), (440). Kết quả này giống với kết quả được tham khảo từ bài báo.
Hình 4.2 là giản đồ nhiễu xạ tia X chuẩn các ôxít sắt. Từ các giản đồ nhiễu xạ chúng ta nhận thấy các đỉnh nhiễu xạ của vật liệu Fe3O4 và γ-Fe2O3 khá giống nhau về vị trí và cường độ tương đối. Các đỉnh nhiễu xạ của γ-Fe2O3 hơi dịch về phía có góc nhiễu xạ lớn hơn so với Fe3O4, một vài đỉnh khác biệt có cường độ nhỏ rất khó xác định đối với các giản đồ nhiễu xạ không thực sự sắc nét. Từ phương trình Scherrer, chúng tôi tính được kích thước tinh thể tương ứng mặt mạng (311) là khoảng 13 nm.
Hình 4.2. Giản đồ nhiễu xạ XRD của các mẫu oxit sắt Fe3O4 và γ-Fe2O3
a) Phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR
Đối với hệ kín, chúng tôi khảo sát quá trình chuyển pha của hạt trần Fe3O4 theo nhiệt độ sấy, cụ thể là theo bốn điều kiện như sau: sấy khô hạt trần ở 50°C, 70°C trong không khí và chân không. Sau khi sấy hạt trần Fe3O4 ở bốn điều kiện trên ta thấy màu sắc của chúng rất khó phân biệt như được trình bày ở hình 4.3.
Hình 4.3. Màu sắc của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín và sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C, 70°C trong chân không và ngoài không khí.
Đem 4 mẫu trên đi đo phổ FT-IR thu được kết quả:
Hình 4.4. Phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín và sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C, 70°C trong chân không và ngoài không khí.
Hình 4.4trình bày kết quả đo phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín và sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C, 70°C trong chân không và ngoài không khí (50 CK, 70 CK: sấy khô 50°C, 70°C trong chân không; 50 KK, 70 KK: sấy khô 50°C, 70°C trong không khí). Kết quả cho thấy chỉ có phổ của mẫu hạt trần Fe3O4 được sấy khô ở 70°C trong điều kiện có không khí cho thấy các dao động đặc trưng Fe-O lần lượt xuất hiện tại các vùng có số sóng 727, 696, 634, 588, 480 cm- 1(tương ứng với số thứ tự ( ), (2), (3), (4), (5) được kí hiệu trên hình). So sánh với phổ FT-IR của γ-Fe2O3 chứng tỏ mẫu hạt trần Fe3O4 được sấy khô ở 70°C trong điều kiện có không khí đã tồn tại pha γ-Fe2O3.
Từ kết quả đo trên chúng tôi có thể kết luận rằng mẫu hạt trần Fe3O4 được tổng hợp ở 50°C trong hệ kín, sau khi sấy khô ở 70°C trong không khí thì dần chuyển sang pha γ-Fe2O3.
Hình 4.5. So sánh phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 và γ-Fe2O3
b) Phân tích dạng hình học và kích thƣớc của hạt nanô ôxít sắt từ
Hình 4.7. Ảnh TEM hạt trần Fe3O4 ở nhiệt độ phòng.
Dựa vào kết quả chụp TEM ở hình 4.6 ta có thể nhận thấy rằng kích thước hạt trần Fe3O4 khá đồng đều và kích thước hạt trung bình nhỏ hơn 20 nm.
Trên ảnh chụp TEM hình 4.7 là hạt trần Fe3O4 được tổng hợp trong hệ kín ở nhiệt độ phòng, ta thấy kích thước của chúng không đồng đều và sự phân tán chưa tốt. Do đó, chúng tôi không chọn điều kiện nhiệt độ phòng để tổng hợp hạt trần Fe3O4. Bên cạnh đó, dựa vào tài liệu tham khảo, kích thước hạt nhỏ nhất ở 50°C, vì vậy điều kiện nhiệt độ này được chúng tôi chọn để đưa vào quy trình tổng hợp hạt trần Fe3O4.
4.1.2. Khảo sát hạt nanô ôxít sắt siêu âm và khuấy cơ a) Phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR a) Phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR
Với mục tiêu là tạo ra hạt nanô ôxít sắt có kích thước hạt nhỏ hơn 20 nm và độ từ hóa cực đại lớn, chúng tôi chọn đối tượng tổng hợp là hạt nanô ôxít sắt có pha Magnetite – Fe3O4. Từ cơ sở lý thuyết tổng quan và kế thừa kết quả trước đây của nhóm nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nanô ôxít sắt theo quy trình ở hình 3.1 với sự thay đổi siêu âm và khuấy cơ được trình bày ở bảng 4.2, nhiệt độ giữ ở 50°C lần lượt trong môi trường khí Argon. Hạt sau kết tủa sẽ được sấy khô trong môi trường chân không ở 50°C.
Hình 4.8. Phổ FT-IR của các mẫu hạt trần Fe3O4 được tạo bằng siêu âm và khuấy cơ. và khuấy cơ.
Bảng 4.2. hảo sát hạt nanô ôxít sắt siêu âm và khuấy cơ. Mẫu FeCl 2.4H 2O FeCl 3.6H 2O Nhiệt độ(°C) Sử dụng Siêu âm Khuấy cơ
M1 3.1736g 7.5684g 50°C 600
M2 3.1736g 7.5684g 50°C
Trên kết quả FTIR hình 4.8 là hạt trần Fe3O4 được tổng hợp trong hệ kín ở vẫn giữ pha tinh thể không có sự chuyển sang pha γ-Fe2O3. Do đó, chúng tôi phân tích dạng hình học và kích thước của hạt nanô ôxít sắt từ để chọn phương pháp tốt nhất vào quy trình tổng hợp hạt trần Fe3O4.
b) Phân tích dạng hình học và kích thƣớc của hạt nanô ôxít sắt từ.
Hình 4.9. Ảnh TEM hạt nanô ôxít sắt bằng siêu âm (bên trái) và khuấy cơ (bên phải).
Dựa vào kết quả chụp TEM ở hình 4.9, ta có thể nhận thấy rằng mẫu siêu âm cho kết quả hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 tròn và đồng đều kích thước trung bình nhỏ hơn 20 nm.
So sánh kết quả chụp TEM với kết quả tính kích thước hạt bằng công thức Scherrer từ phổ XRD của mẫu ở 50o
C, chúng tôi thấy kết quả này tương đối phù hợp với nhau .
Từ những kết quả trên, chúng tôi đã tổng hợp thành công bột sắt từ Fe3O4 có tính chất siêu thuận từ, với kích thước hạt nhỏ hơn 20 nm. Do vậy, chúng tôi chọn phương pháp siêu âm và ở nhiệt độ 50o
C môi trường chân không trong quá trình tạo hạt cho các bước khảo sát tiếp theo.
4.2.Xử lý hạt nanô ôxít sắt Fe3O4
Nhằm mục đích giảm kết tụ, tăng độ phân tán, kích thước hạt đồng đều hơn và đặc biệt là hình thành nhóm –OH hoặc –CH2 để liên kết với lớp chức năng tiếp theo, tức là lớp vỏ SiO2, nên chúng tôi đã chọn HNO3 và OA để xử lý hạt Fe3O4 . Tuy nhiên, theo tham khảo kết quả của một số bài báo nghiên cứu [12] chúng tôi thấy rằng quá trình tổng hợp và xử lý bằng OA trực tiếp sẽ tiết kiệm thời gian và tiết kiệm hóa chất hơn. Vậy bài khóa luận này chúng tôi tiến khảo sát ba quá trình xử lý hạt Fe3O4 theo như bảng :
Bảng 4.3. Các điều kiện xử lý hạt Fe3O4 của 3 mẫu M1, M2 và M3.
Tên mẫu Xử lý
Điều kiện phản ứng Điều kiện sấy Nhiệt độ Môi trường Nhiệt độ Môi trường
M1 HNO3 30°C Không khí 50°C Chân không