1.3 Phương pháp đơn lớp tự lắm ghép
1.3.2 Các phương pháp cố định enzyme
1.3.2.1 Phương pháp vật lý
Nguyên tắc của phương pháp hấp phụ vật lý như sau:
Hấp phụ enzym lên chất mang nhờ lực tương tác yếu giữa chất mang và protein như lực Van der Waals, liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Khi chất mang không có lỗ xốp, enzym bám trên bề mặt chất mang. Khi chất mang có lỗ xốp, enzym chui vào trong các lỗ xốp của chất mang.
Nếu chất mang có chứa điện tích, liên kết giữa chất mang và enzym là liên kết ion (Liên kết này bền hơn so với hấp phụ).
Một số chất mang thường sử dụng để cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ hay liên kết ion:
Chất mang hữu cơ: than hoạt tính, cellulose, tinh bột, dextran, collagen, albumin, agarose, chitin.
Chất mang vô cơ: silic, thủy tinh xốp, oxide kim loại.
Chất trao đổi ion: amberlit, DEAE – sephadex CM – sephadex, DEAE – celllulose, CM – cellulose.
Polymer tổng hợp: polyamide, polyacrylamide, polystyrol, nilon, polyvinyl. Phương pháp điều chế: Cho enzym và chất mang tiếp xúc với nhau (khuấy trộn), sau đó rửa để loại bỏ những phân tử bị gắn yếu lên chất mang.
Các yếu tố ảnh hưởng đến lượng enzym cố định được và độ bền của liên kết cố định
Nồng độ protein enzym: lượng enzym cố định lên chất mang thường tỷ lệ thuận với nồng độ của nó ởmột giới hạn nhất định.
pH: pH môi trường phụ thuộc vào số lượng và bản chất của các nhóm tích điện ở chất mang cũng như ởprotein enzym. Sự thay đổi pH thường ảnh hưởng lớn đến lượng enzym cố định được bằng liên kết ion. Đồng thời sựthay đổi pH đột ngột thường dẫn đến sự nhả hấp phụ của enzym.
Lực ion của môi trường: sự có mặt của các muối tích điện trái dấu với chất mang có thể kéo theo sự kết tủa cục bộ của protein trong dung dịch. Tuy nhiên, sự có mặt của muối cũng có thể làm tăng độ hòa tan của protein do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả cố định.
Nhiệt độ: nhiệt độ tăng làm duỗi mạch protein enzym, do đó làm tăng liên kết protein enzym với chất mang, nhưng cũng làm mất hoạt tính của enzym.
Khối lượng phân tử và bản chất của chất mang: enzym có khối lượng phân tử càng nhỏ thì hấp phụ càng cao. Những chất mang có chứa nhiều nhóm háo nước hấp phụ tốt hơn và bền hơn.
Tuy nhiên sự cố định vật lý ngày nay ít được sử dụng do sự có mặt của enzym trong dung dịch không giữ được hoạt tính trong thời gian dài. Do đó sự cố định hóa học, sử dụng các liên kết đồng hóa trị sẽ đảm bảo độ bền của enzym trong một thời gian khá dài.[21-24]
1.3.2.2 Phương pháp liên kết ngang (crosslinking)
Sự tạo liên kết ngang là quá trình sử dụng một tác nhân đa chức để tạo cầu nối giữa các nhóm xúc tác sinh học khác nhau hay protein khác nhau để tạo ra một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn rất nhiều và không có tính hòa tan.
Có thể tạo liên kết ngang các phân tử của cùng enzym hay cố kết hai hay nhiều protein với nhau (enzym với enzym hay enzym với protein hoặc nhiều enzym trên protein mang chẳng hạn như albumin trong huyết thanh của bò (BSA). Ngay cả cơ quan hay các tế bào cũng có thể kết dính được bằng việc tạo ra các liên kết ngang. Glutaraldehyde là một trong những tác nhân tạo liên kết ngang thường được sử dụng trong việc cố định enzyme. Tác nhân này có hai nhóm chức aldehyde ở các đầu mạch, các nhóm chức này sẽ phản ứng với nhóm amine trên phân tử protein hay enzym và tạo ra các hợp chất mang tính base:
Cũng có thể thay Glutaraldehyde bằng tác nhân hai chức khác như hexamethylene diisocyanate O=C=N-(CH2)6-N=C=O làm tác nhân tạo liên kết ngang.
Có 3 phương pháp chính để cố định enzym bằng liên kết ngang:
Phương pháp ngâm: điện cực sau khi được làm sạch bề mặt được ngâm vào trong dung dịch tác nhân tạo liên kết và enzyme để cố định enzyme lên bề mặt điện cực. Ưu điểm của phương pháp này là phương pháp thực hiện đơn giản, thích hợp cho việc cố định các enzyme lên đa số các bề mặt điện cực, đặc biệt là các bề mặt nhỏ.
Phương pháp kết hợp trực tiếp: dung dịch enzyme và tác nhân liên kết được nhỏ trực tiếp lên bề mặt điện cực. Ưu điểm của phương pháp này là tiết kiệm
enzyme, nó thường được sử dụng để cố định các loại enzyme có giá thành cao, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là chỉ thích hợp đối với các điện cực có bề mặt lớn.
Phương pháp sử dụng bình phun: điện cực được ngâm trong enzyme sau đó được làm khô và glutaraldehyde được phun lên bề mặt điện cực dưới dạng hơi sương ở một khoảng cách đủ lớn để tránh tạo giọt, sau khi tạo liên kết ngang điện cực được rửa lại với nước. Ưu điểm của phương pháp này là lớp enzyme mỏng làm cho cảm biến có thời gian đáp ứng ngắn.[25]
1.3.3 Phương pháp đơn lớp tự lắp ghép (self assembly monolayer – SAM) 1.3.3.1 Khái niệm về phương pháp đơn lớp tự lắp ghép