Kết quảtheo dõi đánh giá khảnăng phát triển của tếbào sau 48h như bảng 4.3:
Bảng 4.3. Kết quả theo dõi năng suất sinh sản của tế bào sau 48h nuôi cấy
Giá trị
DO (%)
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Tỉ lệ sinh sản trung bình SLTB (×109) Tỉ lệ sinh sản của TB SLTB (×109) Tỉ lệ sinh sản của TB SLTB (×109) Tỉ lệ sinh sản của TB 30 1,8 1,8 1,7 1,7 1,6 1,6 1,7 40 2,0 2,0 1,9 1,9 2,1 2,1 2,0 50 2,5 2,5 2,6 2,6 2,5 2,5 2,53 60 2,3 2,3 2,4 2,4 2,3 2,3 2,33
Từ kết quả bảng 4.3 chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ năng suất sinh sản của tế bào PK 15 tại thời điểm 48h nuôi ở các giá trịDO khác nhau như hình 4.3
Hình 4.3. Năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau
Theo kết quả tại bảng 4.3 và hình 4.3 cho thấy:
Giá trị DO ảnh hưởng lớn của đến khảnăng sống và phát triển của tế bào cụ
sinh sản của tế bào cao nhất (2,53 lần). Trong khi lượng DO trong bình nuôi thấp (30-40%) làm cho quá trình sinh trưởng, trao đổi chất của các tế bào bị ức chế, tỉ
lệ sinh sản của tế bào sau 48 giờ nuôi cấy kém (1,7 đến 2 lần). Bên cạnh đó, lượng
DO cao 60% cũng không tốt cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, do
lượng oxy hòa tan nhiều kết hợp với các chất thải ra trong quá trình trao đổi chất của tế bào tạo ra nhiều CO2 gây độc cho tế bào. Tỷ lệ sinh sản của tế bào sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường có giá trị DO 60% chỉ đạt (2,33 lần). Từ những kết quả khảo sát trên, chúng tôi lựa chọn giá trị DO thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 là 50% với quy mô 10 lít.
4.1.1.3. Xác định lưu lượng khí cấp vào thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Hệ thống khí gồm 4 khí O2, N2, CO2 và không khí đuợc phối trộn tự động rồi theo ống dẫn đi vào trong bình nuôi cấy. Hệ thống cho phép cài đặt lưu lượng khí thích hợp cho việc nuôi tếbào. Lưu lượng khí tối đa đi vào bình nuôi cấy là 1
lít/phút. Để xác định lưu lượng khi phù hợp, chúng tôi đã khảo sát các mức lưu lượng khi khác nhau cho bình nuôi cây thu được kết quảnhư bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quảđiều chỉnh lưu lượng khí cấp vào môi trường nuôi Lưu Lưu
lượng khí cấp vào
(lít/phút)
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Tạo bọt Thời gian ổn định DO Tạo bọt Thời gian ổn định DO Tạo bọt Thời gian ổn định DO
0,2 Không 11h Không 11h Không 10h
0,4 Không 8h Không 10h Không 9h
0,6 Không 9h Không 8h Không 8h
0,8 Có 7h Có 8h Có 8h
Kết quả trên cho thấy, khi lưu lượng khí cấp vào trong bình nuôi cấy cao 0.8 lít/phút thời gian ổn định DO rút ngắn lại (7-8h), nhưng tạo bọt khí trong bình nuôi cấy. Trong khi đó, lưu lượng khí đưa vào thấp (0,2-0,3 lít/ phút) thì thời gian ổn
định DO kéo dài (10-11 giờ).
Như vậy, lưu lượng khí cấp vào trong bình nuôi cấy PK 15 thích hợp là 0,6 lít/phút, thời gian ổn định DO dao động từ 8-9h.
Hình 4.4. Hệ thống khí đi vào hệ thống Microcarrier 4.1.2. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào 4.1.2. Nghiên cứu số lượng đầu vào của tế bào
Sau khi xác định được các thông số cài đặt hệ thống Microcarrier thích hợp nhất nuôi cấy tế bào PK 15, tiến hành xác định mật độđầu vào tế bào PK 15 thích hợp trên hệ thống Microcarrier 10 lít.
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 3 lô liên tiếp, các kết quả thí nghiệm
được tổng hợp như bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quảxác định sốlượng tế bào PK 15 thích hợp cho nuôi cấy
Mật độ tế bào
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Năng suất sinh sản TB sau 72h % TB bám sau 24h Năng suất sinh sản sau 72h % TB bám sau 24h Năng suất sinh sản sau 72h % TB bám sau 24h Năng suất sinh sản sau 72h 0,5x105tế bào/ml 5-10 4,45 10-15 4,41 5-10 4,51 4,46±0,06 1x105tế bào/ml 10-15 4,56 20-25 4,62 15-20 4,49 4,56±0,07 1,5x105tế bào/ml 20-25 4,85 25-30 4,92 25-30 4,95 4,9±0,05 2x105tế bào/ml 30-35 3,89 30-40 3,95 35-40 3,95 3,93±0,03
Từ kết quả bảng 4.5 chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ năng suất sinh sản của tế bào PK 15 tương ứng với từng mật độ tếbào đầu vào khác nhau như hình 4.5.
Hình 4.5. Năng suất sinh sản của tế bào PK 15 theo mật độ tếbào đầu vào khác nhau
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mật độ tế bào đầu vào khác nhau ảnh hưởng
đến tỷ lệ tế bào bám hạt sau 24h. Với mật độ 0,5 x 105 tế bào/ml, 1x105 tế bào/ml tỷ lệ hạt có tế bào bám và phát triển thấp tương ứng là (5-10%) và (15-20%) sau
24h. Đồng thời, có sự khác biệt tương đối lớn ở mật độ tếbào đầu vào là 2 x 105 tế
bào/ml so với mật độ tếbào đầu vào 1,5x 105 tế bào/ml. Tỷ lệ tế bào bám hạt phát triển sau 24h khi nuôi với mật độ 2 x 105 tếbào/ml đạt 30-40%. Tuy nhiên, khi xác
định năng suất sinh sản của tế bào sau 72h nuôi cấy thì số liệu lại trái ngược với tỷ
lệ tế bào bám trên bề mặt hại Microcarrier tại thời điểm 24h. Nếu như tại thời điểm 24h nuôi cấy với mật độ tếbào đầu vào là 2x105 tế bào/ml tỏ ra ưu thếhơn với tỷ
lệ tế bào bám hạt đạt đến 40% nhưng đến thời điêm 72h nuôi cấy năng suất sinh sản của tế bào chỉ đạt 3,93 lần. Trong khi đó, với mật độ tếbào đầu vào là 1,5x105 tế bào/ml tại thời điểm 24h tỷ lệ tế bào bám hạt chỉ đạt khoảng 25% nhưng đến thời điểm 72h nuôi cấy, năng suất sinh sản của tế bào lại đạt 4,9 lần.
Điều này có thểđược giải thích như sau: với mật độ tế bào đầu vào là 2x105 tế bào/ml thì sốlượng tếbào ban đầu vào nhiều hơn số hạt nên có rất nhiều tế bào bám trên bề mặt của cùng một hạt dẫn đến tỷ lệ tế bào bám hạt cao ngay từ đầu. Tuy nhiên vì số tế bào nhiều hơn số hạt nên cũng có rất nhiều tế bào không có bề
nuôi cấy năng suất sinh sản của tế bào không cao. Bên cạnh đó, với mật độ tế bào
đầu vào là 1,5x105 tế bào/ml, số lượng tế bào tương thích với số lượng hạt Microcarrier nên hầu hết tế bào đều bám lên bề mặt các hạt Microcarrier và sinh
trưởng phát triển được nên đến thời điểm 72h sau nuôi cấy năng suất sinh sản của tếbào đạt cao nhất gấp 4,9 lần tếbào ban đầu.
Từ những kết quả trên chúng tôi lựa chọn mật độ tế bào PK 15 cấy vào Microcarrier là 1,5 x 105 tế bào/ml.
Dưới đây là một số hình ảnh nuôi tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ.
Hình 4.6. Hình ảnh tế bào PK 15 trên Microcarrier
(a. Hình ảnh tế bào 24h; b. Hình ảnh tế bào 48h; c. Hình ảnh tế bào 72h; d. Hình ảnh tế bào 96h)
4.1.3. Xác định môi trường nuôi cấy và pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier thống Microcarrier
4.1.3.1. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Năng suất sinh sản tế bào ảnh hưởng trực tiếp bởi môi trường nuôi không thích hợp. Để tìm ra công thức môi trường nuôi tối ưu nhất cho sự phát triển cũng như sự
nhân của tế bào, tiến hành thí nghiệm nuôi cấy tế bào PK 15 trên 4 công thức môi trường khác nhau là MEM 5%FBS+KS, DMEM 5%FBS+KS, M199 5%FBS+KS và LH 5%FBS+KS. Sau 3 lô thử nghiệm liên tiếp với 4 loại môi trường nuôi cấy
Bảng 4.6. Khả năng bám và phát triển tế bào PK 15 trên các loại môi trường Thời gian Thời gian theo dõi Mức độ bám tế bào PK 15 (%) MEM 5%FBS+KS DMEM 5%FBS+KS M199 5%FBS+KS LH 5%FBS+KS 24 20-30 10-20 10-20 10-20 48 60-70 50-60 40-50 30-40 72 90-100 70-80 60-70 50-60 96 100 90-100 80-90 80-90
Qua quá trình theo dõi ở cả 4 loại môi trường nuôi:
MEM 5% FBS+KS, DMEM 5% FBS+KS tế bào PK 15 sau 72-96 giờ nuôi tế
bào bám kín tất cả các hạt Cytodex.
M199 5% KS và LH 5%FBS+KS tế bào PK 15 sau 96 giờ chỉ phủ 80- 90% hạt Cytodex.
Hiện tại, hệ thống nuôi trên chai T-fask 225cm2 chúng tôi đang sử dụng môi
trường MEM 5% FBS+KS, nuôi 72 giờ, cho năng suất nhân là 5 lần.
Theo dõi thí nghiệm, tiến hành lấy mẫu theo dõi mức độ phát triển của tế bào trên kính hiển vi và đếm số tế bào sau 72 giờ. Kết quả thu được năng suất nhân của tế bào PK 15 trên từng loại môi trường nuôi khác nhau.
Bảng 4.7. Bảng năng suất tế bào PK 15 trên các loại môi trường tại thời điểm 72h nuôi cấy
Môi
trường
Lô 01 Lô 02 Lô 03
NSSS trung bình SLTB (×109) NSSS của TB SLTB (×109) NSSS của TB SLTB (×109) NSSS của TB LH 3,3 2,20 3,6 2,40 3,54 2,36 2,32±0,11 M199 4,95 3,3 5,07 3,38 4,86 3,24 3,31±0,07 DMEM 5,25 3,50 5,43 3,62 5,37 3,58 3,57±0,06 MEM 6,33 4,22 6,45 4,30 6,27 4,18 4,23±0,06
Từ kết quả bảng 4.7, tôi tiến hành dựng biểu đồ thể hiện năng suất sinh sản của tế bào tại thời điểm 72 giờdưới hình 4.7.
Hình 4.7. Năng suất sinh sản của tếbào trên các môi trường nuôi
Mỗi một loại tế bào khác nhau sẽ phù hợp với các công thức môi trường nuôi khác nhau, cho nên phải tìm công thức môi trường nuôi thích hợp và tối ưu nhất cho tế bào. Lựa chọn được môi trường tối ưu nhất cần đủ hai yếu tố: tốc độ phát triển và
năng suất nhân lên của tế bào. Từ kết quả bảng 4.6 và 4.7 môi trường MEM là môi
trường nuôi tế bào PK 15 có tốc độ phát triển nhanh và mạnh nhất (sau 72 giờ nuôi tếbào bám 100%) và năng suất nhân lên của tế bào cao nhất (4,23 lần).
Sử dụng phần mềm Minitab 16 (ANOVA) nhận thấy P< 0,005; chúng tôi lựa
chọn môi trường MEM bổsung 5% FBS và kháng sinh là môi trường nuôi tế bào
PK 15 trên hệ thống Microcarrier cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3.2. Xác định môi pH thích hợp cho tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Kết quả khảo sát sựảnh hưởng của pH đến khả năng bám hạt của tế bào PK 15 và năng suất sinh sản của tế bào qua 3 lô thí nghiệm được chúng tôi tổng hợp
như bảng 4.8.
Bảng 4.8. Kết quảxác định tỉ lệ hạt có tế bào bám sau khi nuôi cấy 24h với các điều kiện pH khác nhau
pH
Lô 01 Lô 02 Lô 03
Tỷ lệ hạt có TB sống bám (%) Sốlượng tế bào (×109) Tỷ lệ hạt có TB sống bám (%) Sốlượng tế bào (×109) Tỷ lệ hạt có TB sống bám (%) Sốlượng tế bào (×109) 7,0±0,1 70-80 2,65 80-90 3,25 80-90 3,15 7,2±0,1 60-70 2,35 70-80 2,70 70-80 2,9 7,4±0,1 40-50 1,35 50-60 1,70 40-50 1,10
Kết quả trên cho thấy, nuôi tế bào PK 15 ở pH = 7,4±0,1 tỉ lệ tế bào sống bám hạt thấp nhất xấp xỉ 50%. Trong khi đó nuôi tế bào trong điều kiện pH = 7,0±0,1 cho tỉ lệ tế bào sống bám hạt cao trên 70%, đặc biệt ở pH = 7,0±0,1 cho tỉ
lệ tế bào sống bám hạt cao nhất từ 80-90%. Tuy các tế bào đã bám hạt, nhưng năng suất sinh sản của tế bào sẽ khác nhau. Do vậy, kết quả theo dõi năng suất sinh sản của tế bào sau 72h nuôi cấy được tổng hợp như bảng 4.9:
Bảng 4.9. Kết quảxác định điều kiện pH thích hợp cho nuôi cấy tế bào PK 15 tại thời điểm 72h nuôi cấy
pH
Lô 01 Lô 02 Lô 03
NSSS trung bình SLTB (×109) NSSS của TB (×10SLTB 9) NSSS của TB (×10SLTB 9) NSSS của TB 7,0±0,1 6,71 4,47 6,975 4,65 6,555 4,37 4,50±0,14 7,2±0,1 6,62 4,41 6,72 4,48 6,555 4,37 4,42±0,06 7,4±0,1 5,57 3,71 5,78 3,85 5,46 3,64 3,73±0,11
Từ bảng 4.9 ta có đồ thị thể hiện năng suất sinh sản của tếbào như hình 4.8
Hình 4.8. Năng suất sinh sản của tế bào khi nuôi cấy ở các pH khác nhau
Tổng hợp kết quả bảng 4.8 và bảng 4.9 và hình 4.5 chúng tôi nhận thấy có sự
khác biệt rõ rệt khi nuôi tế bào PK- 15 trong điều kiện pH = 7,0±0,1 so với pH =7,4±0,1. Khi nuôi cấy tế bào PK 15 trong điều kiện pH 7,0±0,1 tế bào phát triển tốt cho năng suất sinh sản của tếbào cao hơn sau 72 giờ nuôi cấy. Không nên nuôi cấy tế bào trong điều kiện pH cao (pH=7,4±0,1) sẽ làm ảnh hưởng tới khả năng
Kết luận: Chọn pH = 7,0±0,1 là điều kiện pH tối ưu nhất cho nuôi cấy tế bào PK 15 quy mô 10 lít.
4.1.4. Xác định đường cong sinh trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier Microcarrier
Tiến hành thí nghiệm và đếm sốlượng tế bào tại các thời điểm 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h. Lặp lại thí nghiệm 3 lần thu được kết quảnhư sau:
Bảng 4.10. Kết quả sốlượng tế bào PK 15 theo thời gian nuôi cấy trên Microcarrier
Lô thí nghiệm
Số lượng tế bào (x 109tế bào/ml) TB đầu vào 24h 48h 72h 96h 120h 144h Lô 01 1,5 1,61 4,56 7,61 7,39 7,36 7,06 Lô 02 1,5 1,57 4,52 7,71 7,48 7,27 6,93 Lô 03 1,5 1,59 4,61 7,75 7,35 7,25 7,1 Trung bình 1,5 1,59 4,56 7,69 7,41 7,29 7,03 NSSS trung bình 1,06 3,04 5,13 4,94 4,86 4,69
Từ kết quả bảng trên chúng tôi tiến hành dựng biểu đồ đường cong sinh
trưởng tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier như hình:
Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier 10 lít cho thấy: Giai đoạn 24 giờ sau nuôi các tế bào mới bám hạt hầu như chưa phát triển. Sau 24h nuôi cấy, khi các tế bào đã bám lên hạt ổn định và bắt đầu pha sinh trưởng và đạt cao nhất ở 72h sau nuôi cấy (tỷ lệ sinh sản ~1:5,13) so với ban đầu. Ở giai đoạn sau 72h nuôi cấy, số lượng tế bào có hiện
tượng giảm nhẹ do một số tế bào chết bong tróc vào môi trường. Tuy nhiên sau
đó thì sốlượng tếbào được duy trì tương đối ổn định do tế bào mới sinh ra lấp vào vị trí các tế bào chết đã bong.
Sau khi chốt các thông số cho quy trình nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier. Tôi tiến hành so sánh năng suất sinh sản tế bào thu được trên hệ
thống Microcarrier với hệ thống T-flask đã được công ty áp dụng sản xuất trước
đó tại các thời điểm thu hoạch: 24h, 48h, 72h, 96h thông qua đồ thị sau:
Hình 4.10. Đồ thịso sánh năng suất sinh sản tếbào thu được trên hệ thống Microcarrier và hệ thống T-flask
Nhìn vào hình 4.10 ta thấy năng suất sinh sản của tế bào PK 15 trên hệ
thống Microcarrier cao hơn T-flask tuy nhiên sự chênh lệch không nhiều. Khi xét về mật độ tế bào trên một thể tích nuôi cấy thì tế bào PK 15 trên hệ thống
Microcarrier cao hơn hẳn T-flask. Cụ thể tại thời điểm 72h nuôi cấy : trên T-flask
thu được 320000 - 340000 tb/ ml còn trên hệ thống microcarrier thu được 770000
tb/ml. Như vậy, tế bào PK 15 nuôi trên hệ thống Microcarrier cao gấp 2 lần T- flask. Mặt khác, khi sử dụng công nghệ Microcarrier còn giảm thiểu nhận lực làm việc, giảm thiểu tạp trùng, hạn chế thao tác, hệ thống gọn không cồng kềnh, không