Phần 3 Nội dung vật liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp gây nhiễm
3.5.2.1. Phương pháp xác định môi trường duy trì và pH của môi trường duy trì
Môi trường cho nuôi cấy vi rút DTL là thành phần quan trọng ảnh hưởng đến hiệu giá của vi rút thu được. Đểxác định được loại môi trường thích hợp cho nuôi vi rút DTL trên hệ thống Microcarrier, chúng tôi tham khảo môi trường nuôi cấy DTL trên chai phẳng và tiến hành nuôi cấy vi rút DTL thử nghiệm trên hệ thống Microcarrier với các loại môi trường khác nhau:
Lactanbumin Hydrolysate (LH),Medium 199 (M199),Minimum Essential Medium (MEM), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Bốn loại môi trường trên được pha bổ sung thêm một số thành phần như (Thể tích/ Thể
tích): 1% huyết thanh bào thai bê (FBS) +0,1% kháng sinh + 1% Hepes 1M, pH= 7,0±0,1.
Cài đặt thông số cho hệ thống như sau: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,6 lít/phút; DO=50%.Thí nghiệm được bố trí trong bảng 3.7
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi Môi trường nuôi
cấy Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi LH
10 lít 3 lần
Hiệu giá vi rút Dịch tả
lợn nhân lên sau 72 giờ
gây nhiễm.
M199 MEM DMEM
Khi có kết quảxác định được loại môi trường duy trì chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định pH môi trường nuôi cấy như dưới bảng:
Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm xác định pH tối ưu cho nuôi cấy pH của môi pH của môi
trường nuôi cấy Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 7,0±0,1
10 lít 3 lần
Hiệu giá vi rút Dịch tả
lợn nhân lên sau 72 giờ gây nhiễm.
7,2±0,1
7,4±0,1
3.5.2.2. Phương pháp xác định liều nhiễm của vi rút
Với mục đích thu được nguyên dịch vi rút DTL có hiệu giá tối ưu nhất, chúng tôi tiến hành xác định liều gây nhiễm thích hợp (multiplicity of infection –
MOI). Phương pháp gây nhiễm vi rút DTL được thực hiện với 4 liều MOI khác
nhau (0,01;0,005;0,001; 0,0005). Cài đặt thông số cho hệ thống như sau: tốc độ
khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,6 lít/phút; DO=50%. Bố trí thí nghiệm được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm xác định liều gây nhiễm thích hợp MOI Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi MOI Thể tích nuôi cấy Số lần lặp lại Chỉ tiêu theo dõi 0,01 10 lít 3 lần Hiệu giá vi rút Dịch tả lợn nhân lên tại các thời điểm 24, 48, 72 và 96 giờ gây nhiễm. 0,005 0,001 0,001
3.5.2.3. Phương pháp xác định đường cong sinh trưởng của vi rút DTL
Tiến hành gây nhiễm vi rút DTL với liều MOI = 0,001; ủ 90 phút trong tủ
370C, các thông số cài đặt: tốc độ khuấy 60 vòng/phút; lưu lượng khí 0,6 lít/phút;
DO=50%; môi trường duy trì MEM 1% FBS + 0,1%kháng sinh; pH = 7,2±0,1.
Thu hoạch vi rút tại các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h, 80h, 96h, 108h, 120h sau gây nhiễm vi rút.
*) Giống nhiễm
Giống vi rút nhược độc Dịch tả lợn tế bảo của công ty Hanvet; Hiệu giá 106,0 TCID50/ml.
*) Gây nhiễm
Bước 1: Nuôi cấy nền tế bào PK-15: chúng tôi tiến hành nuôi tế bào PK-15
theo quy trình đã được xây dựng để chuẩn bị nền tế bào PK-15 cho gây nhiễm vi rút Dịch tả lợn.
Kiểm tra tếbào trước khi tiến hành gây nhiễm.
Bước 2: Gây nhiễm vi rút Dịch tả lợn.
Quan sát khi tế bào PK-15 phát triển kín bề mặt hạt Cytodex tiến hành gây nhiễm vi rút Dịch tả lợn. Quy trình thực hiện như sau:
- Sử dụng bình thu 20L để hút loại bỏmôi trường nuôi cây. Rửa tế bào và hạt 2 lần bằng 2 lít Hanks (+) 0,1% KS/ lần.
- Sử dụng chai chia để bổsung 2L môi trường môi trường nuôi cấy có huyết thanh và giống vi rút Dịch tả lợn vào bình nuôi của hệ thống.
- Ủ tế bào PK-15 với vi rút Dịch tả lợn ở 37ºC trong 1 giờ (khuấy đều hạt 20 phút khuấy/ lần).
- Sau 1 giờ bổ sung môi trường nuôi cấy có huyết thanh vừa đủ 10 lít. Tiến hành cài đặt các thông số nhân vi rút Dịch tả lợn: Tốc độ khuấy: 60rpm, pH: 7,0;
DO: 50%; lưu lượng khí : 0,6 lít/phút (khí mix 4 loại CO2, O2, N2, không khí). *) Phương pháp xác định chỉ số TCID50
Mẫu vi rút được pha loãng theo cơ số 10 từ 10-1 – 10-7. Gây nhiễm vi rút đã
pha loãng ở các nồng độ khác nhau lên tế bào PK 15 đã chuẩn bị trước trên phiến 96 giếng đã phủ kín 1 lớp. Mỗi độ pha loãng vi rút gây nhiễm trên 05 giếng. Ghi lại bố trí thí nghiệm trên giếng 96 giếng vào sơ đồ bố trí mẫu rồi chuyển phiến tế
bào đã nhiễm vi rút vào tủ ấm 370C, 5%CO2 trong 72 giờ. Sau thời gian ủ ấm phiến tế bào nhiễm được lấy ra làm phản ừng IFA đểxác định sự có mặt của vi rút trên các giếng tế bào nhiễm.
Dựa vào sự có mặt của vi rút trên các giếng tế bào nhiễm để tính hiệu giá vi rút theo công thức Kabper – Spearman.
Log TCID50 = L – D (
L: là logarit độ pha loãng cao nhất có 100% số giếng nhiễm vi rút.
D: là độ chênh lệch Logarit giữa các độ pha loãng mẫu, ở dãy do pha loãng ở
bậc 10 nên D bằng 1.
S: là tổng số giếng nhiễm vi rút ở các độ pha loãng không có 100% số giếng nhiễm vi rút.
N: là số giếng gây nhiễm cho mỗi độ pha loãng. *) Phương pháp IFA xác định sự có mặt của vi rút DTL
Bước 1: Pha dung dịch:
Dung dịch cốđịnh A: PBS(-) bổ sung 10% Formalin và 1% NP40. Dung dịch rủa B: PBS (-) bổ sung 1% Tween 20.
Bước 2: Cốđịnh đĩa tế bào.
Đĩa chuẩn độ được nuôi 72h sau nhiễm, Mở nắp đĩa, nhẹ nhàng đổ bỏ dịch
môi trường trong đĩa, thấm nhẹ bằng khăn. Bổ sung 100µL/ giếng dung dịch cố định A. Để nhiệt độ phòng 30 phút.
Bước 3: Bổ sung kháng thể 1
Sau 30 phút cốđịnh, đổ bỏ dịch có định
Rửa lần 1: Bổ sung 250-300 µL/ giếng dung dịch rửa B, vỗ nhẹđĩa tế bào
đổ bỏ dịch. Lặp lại 2 -3 lần.
Pha kháng thể 1 trong PBS (-). Bổ sung 50 µL/ giếng kháng thể 1.
Ủ 37oC/ 60 phút, 20 phút láng 1 lần.
Bước 4: Bổ sung kháng thể 2
Sau 60 phút ủ với kháng thể1, đổ bỏ dịch
Rửa lần 2: Bổ sung 250-300 µL/ giếng dung dịch rửa B, vỗ nhẹđĩa tế bào
đổ bỏ dịch. Lặp lại 2 -3 lần.
Pha kháng thể 2 trong PBS (-). Bổ sung 50 µL/ giếng kháng thể 2.
Ủ 37oC/ 60 phút, 20 phút láng 1 lần.
Bước 5: Rửa đĩa và đọc kết quả
Sau 60 phút ủ với kháng thể2, đổ bỏ dịch
Rửa lần 3: Bổ sung 250-300 µL/ giếng dung dịch rửa B, vỗ nhẹđĩa tế bào
Đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang: Tế bào nhiễm vi rút có nguyên sinh chất bắt màu sáng xanh, tế bào nhiễm vi rút không bị bắt màu.