4.1.1.1. Xác định tốc độ khuấy thích hợp để nuôi tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
Tốc độ khuấy nhanh hay chậm đều ảnh hưởng tới sự bám và phát triển tế bào trên bề mặt của các hạt Cytodex. Mặt khác, trong môi trường nuôi tế bào hay môi
trường duy trì tế bào sau nhiễm đều có chứa một lượng huyết thanh nhất định khi tốc độ khuấy không thích hợp sẽ tạo ra bọt gây hiện tượng môi trường trào lên nắp
ảnh hưởng đến vô trùng trong bình nuôi và sự phát triển của tế bào nên tìm ra
được độ khuấy thích hợp là rất cần thiết.
Tiến hành thí nghiệm với 3 tốc độ khuấy 30rpm, 60rpm, 90rpm. Kết quảtheo dõi được trình bày bảng 4.1:
Bảng 4.1. Kết quảtheo dõi điều chỉnh tốc độ khuấy Tốc độ khuấy Tốc độ khuấy
(Vòng/phút) 30 rpm 60 rpm 90 rpm
Khả năng lắng hạt lắng hạt nhanh không lắng không lắng
Tạo bọt môi trường không tạo bọt không tạo bọt tạo bọt
Độ bám tế bào (%) 24h 10- 20 20- 30 20- 30 48h 30- 40 50- 60 40- 50 72h 60- 70 80- 90 70- 80 96h 80- 90 100 100
Kết quả điều chỉnh tốc độ khuấy cho thấy: Điều chỉnh tốc độ khuấy 30
vòng/phút và 60 vòng/phút môi trường nuôi không tạo bọt tuy nhiên ở tốc độ
khuấy 30 vòng/phút các hạt Cytodex bị lắng xuống đáy bình nhanh còn ở tốc độ
khuấy 60 vòng/phút không bị lắng các hạt Cytodex xuống đáy bình.Ở tốc độ
(1) (2)
Hình 4.1. (1) Bình nuôi có bọt, (2) bình nuôi cấy không có bọt
Độ bám tế bào ở từng tốc độ khuấy khác nhau cũng khác nhau.
•Ở tốc độ khuấy 30 vòng/phút sau 24 giờ nuôi tế bào bám và phát triển khoảng 10- 20%, đến 72 giờ nuôi tế bào bám khoảng 50-60% hạt Cytodex và sau 96 giờ nuôi tế bào PK 15 vẫn chưa bám kín hạt Cytodex khoảng 80-90%, phía đáy bình nuôi các
hạt Cytodex lắng xuống có hiện tượng tế bào phát triển không đều.
•Ở tốc độ khuấy 60 vòng/phút tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi khoảng 20-30%, sau 72-96 giờ tế bào phát triển và bám kín hạt Cytodex 90-100%.
• Tốc độ khuấy 90 vòng/phút do tốc độ khuấy mạnh nên môi trường tạo bọt, tế bào bám và phát triển sau 24 giờ nuôi, sau 96 giờ nuôi tế bào bám kín hạt Cytodex, tuy nhiên mức độ bám tế bào trên hạt Cytodex không đều, hạt dày, hạt
thưa tế bào.
Như vậy, tốc độ khuấy 60 vòng/phút không tạo bọt môi trường nuôi, không làm lắng hạt Cytodex xuống đáy bình, tế bào PK 15 phát triển và bám kín hạt Cytodex sau 72-96 giờ nuôi. Vậy nên chọn tốc độ khuấy 60 vòng/phút làm tốc độ
khuấy cho các thí nghiệm tiếp theo của nuôi tế bào PK 15 trên hệ
thốngMicrocarrier. Kết quả tốc độ phù hợp với nuôi cấy tế bào theo nghiên cứu của GE healthcare (Freshney, 2015).
4.1.1.2. Xác định giá trị DO thích hợp để nuôi cấy tế bào PK 15 trên hệ thống Microcarrier
DO (Dissolved Oxygen) là nồng độ Oxy hòa tan trong nước, hàm lượng O2 trong nước hay môi trường nuôi rất cần thiết cho sự hô hấp của tế bào. Nồng độ oxy trong môi trường thấp sẽ gây ức chế và giảm sự phát triển của tế bào.
Tiến hành thí nghiệm với 4 mức độDO: 30%, 40%, 50%, 60%, lượng tế bào
đầu vào cho 4 giá trị DO là: 1 x109 tế bào/30 gam Micro carrier/bình nuôi cấy 10 lít/giá trị DO.
Kết quả thí nghiệm trình bày bảng 4.2:
Bảng 4.2. Mức độ bám tế bào PK 15 vào hạt Cytodex ở các giá trị DO khác nhau
Thời gian theo dõi Mức độ bám tế bào PK 15 (%)
30 40 50 60
24 10-20 15-20 20-30 20-30
48 30-40 40-50 50-60 30-40
72 60-70 70-80 90-95 70-80
Kết quả theo dõi cho thấy mức độ bám và phát triển của tế bào PK 15 khác nhau ở các giá trị DO khác nhau, sau 24 giờ nuôi tế bào bắt đầu bám vào hạt Cytodex. Tuy nhiên, tế bào ở bình có giá trị DO=30-40% phát triển kém hơn (tế
bào bám khoảng 10-20%) tế bào ở bình DO=50-60% (tế bào bám khoảng 20- 30%). Sau 72 giờ nuôi, DO=30-40% tế bào bám khoảng 70-80% trên bề mặt hạt Cytodex. Giá trị DO=50% sự nhân lên và phát triển của tế bào tốt hơn, bám gần hết kín hạt Cytodex khoảng 90-95%. Giá trị DO=60% sự nhân lên và phát triển của tế bào chậm hơn, bám 70-80% hạt Cytodex.
Sau 48 giờ nuôi tế bào, tiến hành lấy mẫu, tách tế bào xác định năng suất sinh sản của tế bào ở các giá trị DO khác nhau.
Kết quảtheo dõi đánh giá khảnăng phát triển của tếbào sau 48h như bảng 4.3: