Thiết bị Nhà sản xuất Xuất xứ
Tủ ấm CO2 Eppendorf Hoa Kỳ
Máy bách phân Digisystem Đài Loan
Máy hấp dụng cụ Labtech Hàn Quốc
Cân phân tích Sartorius Đức
Máy phân tích tế bào theo dòng chảy (BD C6) BD Accuri Hoa Kỳ
Kính hiển vi Olympus CX23 Nhật Bản
Máy chuẩn độ pH Jenway Anh
Buồng đếm Neubauer cải tiến Assistant Đức
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm
Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm được thực hiện theo quy trình chuẩn của WHO, 2010: Mẫu tinh dịch sau khi xuất tinh được thu nhận vào lọ đựng mẫu chuyên dụng và chờ ly giải từ 15 – 60 phút. Sau đó, mẫu được đánh giá mật độ và độ di động theo quy trình chuẩn của WHO, 2010 [113].
2.3.2. Phương pháp phân tích tinh dịch đồ
- Tinh dịch đồ thực hiện theo các bước sau (WHO, 2010) [113]: + Đặt lọ đựng mẫu trên bàn thao tác hoặc tủ ấm 370C để ly giải. + Đánh giá sự ly giải và tính chất tổng quát của tinh dịch.
+ Đo thể tích tinh dịch. + Đo pH tinh dịch.
+ Chuẩn bị một tiêu bản tươi để đánh giá tổng quát dưới kính hiển vi, sự di động tinh trùng và định độ pha loãng để đánh giá số lượng tinh trùng.
+ Đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng.
+ Tạo phiến phết tinh dịch để đánh giá hình dạng tinh trùng. + Pha loãng tinh dịch để đánh giá mật độ tinh trùng.
+ Đánh giá tổng số tinh trùng trong mẫu.
+ Cố định và nhuộm phiến phết để đánh giá hình dạng tinh trùng.
2.3.3. Quy trình phân tích sự phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (SCSA) khảo sát cấu trúc nhiễm sắc chất (SCSA)
* Xác định độ pha loãng mẫu tinh dịch (WHO, 2010)
- Pha loãng mẫu với dung dịch cố định (NaHCO3 5%) theo tỷ lệ 1/20, 1/5 hay 1/2 tùy theo số lượng tinh trùng được quan sát được trong vi trường.
- Đưa mẫu tinh dịch pha loãng vào buồng đếm và chờ khoảng 3 phút để các tế bào bất động định vị trên các lưới ô vuông.
- Đếm số lượng tinh trùng bằng buồng đếm với kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400X.
- Đếm hai buồng, mỗi buồng đếm ít nhất 200 tinh trùng để hạn chế sai số chọn mẫu.
- So sánh kết quả đếm được ở hai buồng xem sự chênh lệch có chấp nhận được không. Nếu được, tính mật độ tinh trùng trong mẫu theo công thức:
C = (N/n) x (1/20) x hệ số pha loãng x 106 (tinh trùng/mL)
Trong đó:
N: tổng số tinh trùng đếm được trên 2 buồng đếm. n: tổng số hàng đã khảo sát trên 2 buồng đếm. 20: thể tích của 1 hàng trong lưới ô vuông số 4,5,6.
* Quy trình SCSA sử dụng trong phân tích phân mảnh DNA tinh trùng
Bước 1: Pha loãng mẫu tinh dịch trong dung dịch TNE 1X đến mật độ 1 – 2 x 106 tinh trùng/ml.
Bước 2: Xử lý mẫu với dung dịch axit loãng (HCl 0,08N) để biến tính tách mạch đôi DNA.
Bước 3: Nhuộm mẫu với 1200 µl dung dịch nhuộm Acridin Orange trong 30 giây.
Bước 4: Chạy mẫu qua máy Flow Cytometry (FCM).
Điều chỉnh thông số của máy FCM để máy thu nhận 20.000 tế bào với tốc độ 200 – 300 tế bào/giây.
Bước 5: Xử lý số liệu và tính chỉ số DFI bằng phần mềm BD Accuri C6. Số liệu thu được từ 10.000 tế bào sẽ được lọc và loại bỏ các tín hiệu nhiễu, loại bỏ các tế bào HDS (tín hiệu xanh quá cao). Tính chỉ số phân mảnh của từng tinh trùng theo công thức ở mục 1.3.5.1. Sau đó tính tỷ lệ tế bào có phân mảnh DNA ≥ 25% trên tổng số tế bào [35]. Đó là chỉ số DFI trung bình của mẫu tinh dịch thu nhận được.
2.3.4. Phân tích số liệu
Dữ liệu thu được bao gồm: chỉ số DFI được đo bằng phương pháp SCSA (DFI – SCSA), sự liên hệ giữa DFI và các chỉ số tinh dịch đồ như mật độ tinh trùng, độ di động và hình dạng tinh trùng sẽ được phân tích bằng phần mềm R (phiên bản 3.5.0). Mối liên hệ giữa DFI và các chỉ số tinh dịch đồ được kiểm định bằng kiểm định Student hoặc phân tích phương sai (ANOVA). Giá trị < 0,05 được xác định là có ý nghĩa thống kê. Với các so sánh có p-value <0.05 ta tiến hành phân tích tương quan giữa DFI và biến đó bằng kiểm định hệ số tương quan Spearman.
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu này được tiến hành đảm bảo tuân thủ nguyên tắc về đạo đức trong nghiên cứu khoa học.
Đối tượng nghiên cứu được giải thích rõ ràng mục đích và qui trình xét nghiệm trong nghiên cứu, không làm tổn hại đến người bệnh. Người bệnh đồng ý tham gia nghiên cứu. Mẫu sau khi được phân tích được hủy theo đúng quy trình hủy mẫu y tế.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm lâm sàng và đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu
Đặc điểm lâm sàng của 151 bệnh nhân đến khám và điều trị tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu
Đặc điểm Kết quả
Tuổi bệnh nhân (năm) 32,04 ± 5,97
BN có hút thuốc – n (%) 79 (52,3) BN có sử dụng rượu bia – n (%) 134 (88,7) BN có từng bị quai bị – n (%) 33 (21,9) FSH (mIU/mL) 4,35 ± 1,90 LH (mIU/mL) 4,49 ± 1,89 Testosterone (nmol/L) 15,76 ± 5,86
Chú thích: Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bì nh ± độ lệch chuẩn với biến liên tục và số lượng (phầm trăm) với biến phân loại.
Theo số liệu thống kê, độ tuổi trung bình của bệnh nhân đến khám vô sinh nam là 32,04 ± 5,97 tuổi. Nam giới đến khám và điều trị vô sinh có độ tuổi trẻ nhất là 22 tuổi và lớn tuổi nhất là 55 tuổi. Các giá trị nội tiết được khảo sát bao gồm FSH (Follice Stimulating Hormone), LH (Luiteinizing Hormone), Testosterone. Bên cạnh đó, tỷ lệ bệnh nhân có hút thuốc lá chiếm phần lớn trong tổng số những bệnh nhân được nghiên cứu với 79 bệnh nhân (52,3%) và 134 bệnh nhân có sử dụng rượu bia chiếm 88,7%. Điều này cho thấy, đặc điểm về lối sống của bệnh nhân tiếp xúc với các chất kích thích ngày càng tăng và những yếu tố này có ảnh hưởng tiêu cực tới chất lượng tinh trùng cũng như làm tăng sự tổn thương về DNA của tinh trùng người. Vì vậy, trong các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra việc thực hành các lối sống là đặc điểm lâm sàng quan trọng trong điều trị vô sinh nam, đặc biệt là các trường hợp vô sinh nam không rõ nguyên nhân [72].
Tỷ lệ nam vô sinh có tiền sử bị quai bị chiếm số lượng nhỏ với 33 bệnh nhân trong tổng số 151 bệnh nhân được nghiên cứu. Quai bị là bệnh truyền nhiễm cấp tính, gây dịch, do virus quai bị gây nên. Virus quai bị có ái tính đặc biệt với các tuyến ngoại tiết như tuyến nước bọt, tuyến sinh dục (tinh hoàn, buồng trứng) tụy tạng và hệ thần kinh. Giảm sinh tinh trùng sau biến chứng viêm tinh hoàn của bệnh quai bị là một trong những nguyên nhân gây vô sinh nam. Biểu mô sinh tinh bị ảnh hưởng hay bị hủy hoàn toàn do tác động trực tiếp của nhiễm trùng, do hiện tượng viêm, tăng nhiệt độ hoặc do phản ứng miễn dịch sau khi hàng rào máu – tinh hoàn bị phá hủy [101].
Nồng độ FSH trong máu vào ngày bệnh nhân đến khám, làm xét nghiệm tinh dịch đồ có giá trị là 4,35 ± 1,90 mIU/mL. Nồng độ LH của các đối tượng nghiên cứu là 4,49 ± 1,89 mIU/mL). Nồng độ Testosterone trong máu là 15,76 ± 5,86 nmol/L. Nhìn chung, các giá trị này nằm trong giới hạn bình thường về yếu tố nội tiết của nam.
Trục hạ đồi, tuyến yên và tinh hoàn có vai trò quan trọng trong việc kích hoạt quá trình biệt hóa tế bào mầm sinh dục. Trong đó, LH và FSH là hai nội tiết chính trong điều hòa hoạt động quá trình sản sinh tinh trùng. Tuy nhiên, mỗi loại nội tiết đóng vai trò khác nhau. LH tác động lên tế bào Leydig, kích thích quá trình sinh tổng hợp testosterone. FSH lại liên quan trực tiếp đến hoạt động sinh tinh trùng thông qua tác động của tế bào Sertoli. Khi FSH tác dụng lên tế bào Sertoli còn kích thích quá trình hình thành hàng rào máu – tinh hoàn, tạo ra các chất ức chế và cơ chế phản hồi âm lên thùy trước tuyến yên, dẫn đến giảm sản xuất FSH. FSH khi gắn lên tế bào Leydig sẽ kích thích tế bào tăng các thụ thể với LH, từ đó kích thích tuyến yên tăng sản xuất LH.
Theo nghiên cứu của McLachlan (1998) thì ông cho rằng, các yếu tố nội tiết này có vẻ không tác động lên sự tăng sinh hoặc biệt hóa của tinh nguyên bào dạng A [28]. Sản xuất steroid sinh dục, chức năng túi tinh dường như ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của tinh trùng và do đó khả năng thụ tinh của tinh trùng được đề xuất trong nghiên cứu của Richthoff J. và cộng sự (2002) [92].
3.1.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu
Trong các cặp vợ chồng vô sinh đến khám và điều trị tại khoa, có 151 mẫu tinh trùng của người chồng đủ điều kiện nghiên cứu và đặc điểm tinh dịch đồ của các đối tượng được mô tả trong bảng 3.2 dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Bảng 3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ của đối tượng nghiên cứu
Đặc điểm Kết quả
Thời gian kiêng xuất tinh (ngày) 4,18 ± 1,63
Thể tích xuất tinh (mL) 3,05 ± 1,35
Độ pH (độ) 7,45 ± 0,21
Mật độ (x106 tinh trùng/mL) 22,63 ± 14,17
Di động tiến tới PR (%) 25,36 ± 6,13
Di động không tiến tới NP (%) 26,09 ± 5,47
Bất động IM (%) 48,66 ± 9,54
Di động (PR + NP) (%) 51,46 ± 9,69
Tỷ lệ sống (%) 65,15 ± 9,98
Hình dạng tinh trùng (%) 1,16 ± 0,45
Các mẫu tinh dịch được lấy bằng cách thủ dâm và bảo quản trong tủ ấm 370C nhằm để mẫu được ly giải và giải phóng tinh trùng. Các chỉ số tinh dịch đồ bao gồm thời gian kiêng xuất tinh, độ pH, thể tích xuất tinh, mật độ, độ di động – di động tiến tới PR (Progressive), di động không tiến tới NP (Non – Progressive), bất động IM (Immotility), tỷ lệ sống (TLS) và hình thái tinh trùng được phân tích theo tiêu chuẩn của WHO, 2010 [113].
Trong đó, thời gian kiêng xuất tinh trung bình là 4,18 ngày. Thể tích xuất tinh trung bình là 3,05 ± 1,35mL/một lần xuất tinh. Giá trị pH trung bình là 7,45 ± 0,21. Các mẫu xuất tinh có mật độ tinh trùng trung bình là 22,63 ± 14,17 x 106 tinh trùng/mL. Tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới PR là 25,36 ± 6,13%. Tinh trùng di động không tiến tới NP là 26,09 ± 5,47%. Tinh trùng bất động là 48,66
± 9,54%. Các mẫu xuất tinh có tinh trùng có tỷ lệ sống với giá trị trung bình là 65,15 ± 9,98%. Giá trị tinh trùng có hình thái bình thường là 1,16 ± 0,45%.
Các giá trị trung bình về đặc điểm tinh dịch đồ của nam giới vô sinh đến khám và điều trị tại khoa Hỗ trợ Sinh sản – Bệnh viện A Thái Nguyên phần lớn đều nằm trong giới hạn bình thường theo tiêu chuẩn của WHO, 2010. Tuy nhiên, có tỷ lệ tinh trùng di động tiến tới (PR ≥ 32%) chỉ đạt mức 25,36%, tỷ lệ thấp hơn so với tiêu chuẩn. Bên cạnh đó, tỷ lệ tinh trùng có hình dạng bình thường có giá trị xoay quanh 1%, giá trị này thấp so với giá trị bình thường trong Cẩm nang hướng dẫn xét nghiệm và đánh giá tinh chất của WHO, 2010 [113]. Điều này cũng nói lên rằng chất lượng tinh trùng của nam giới ngày càng có xu hướng giảm.
3.2. Kết quả phân tích mức độ phân mảnh DNA của tinh trùng
Sau khi đã thu thập dược các thông tin về đặc điểm lâm sàng và đánh giá các chỉ số tinh dịch đồ của 151 bệnh nhân, chúng tôi tiến hành phân tích mức độ phân mảnh DNA tinh trùng bằng phương pháp SCSA theo khảo nghiệm của Evenson và cộng sự (2000) [47].
Kết quả biểu thị các quần thể tinh trùng có DNA bị phân mảnh ở các mức độ khác nhau được được xử lý theo phần mềm phân tích dữ liệu của máy phân tích dòng chảy tế bào (FCM) và thể hiện trong hình 3.1.
Hình 3.1. Cường độ tín hiệu của tinh trùng sau khi nhuộm AO - mức độ phân
mảnh thấp (a); mức độ phân mảnh trung bình (b); mức độ phân mảnh cao (c); P1: vùng DNA tinh trùng không bị phân mảnh; P2: vùng DNA tinh trùng bị
phân mảnh mức trung bình; P3: vùng DNA tinh trùng bị phân mảnh cao Hình 3.1 thể hiện quần thể các tế bào tinh trùng người với sự bắt màu khác nhau. Trong đó, vùng có các tế bào tinh trùng bắt màu xanh là vùng có chứa những tinh trùng có DNA được nén chặt nên các phân tử AO sẽ không bám được vào các mạch DNA đã được biến tính, dưới năng lượng ánh sáng của tia Laser chúng sẽ có màu xanh. Còn những vùng có tín hiệu màu đỏ là vùng có chứa các tế bào tinh trùng bị đứt gãy DNA nên các phân tử AO bám vào sau khi DNA đã bị biến tính.
Dựa vào cường độ tín hiệu của tinh trùng khi nhuộm AO và công thức trình bày trong phần 1.3.5.1 để tính được giá trị phân mảnh DNA tinh trùng. Cụ thể, các ngưỡng giá trị về mức độ phân mảnh DNA tinh trùng người với các nhóm như sau [47]:
∙ DFI ≤ 15%: tinh trùng có DNA không bị phân mảnh.
∙ 15% < DFI < 30%: tinh trùng có DNA phân mảnh ở mức độ nhẹ. ∙ DFI ≥ 30%: tinh trùng có DNA bị phân mảnh mức độ nặng.
Kết quả phân tích về mức độ phân mảnh DNA tinh trùng của 151 bệnh nhân được thể hiện dưới bảng 3.3: