Chương 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.7. Phương pháp định danh và phân loại chủng loại
2.4.7.1. Phương pháp tách DNA tổng số.
ADN tổng số của các chủng vi khuẩn được tách theo theo các bước sau: 1. Nuôi cấy 1 khuẩn lạc chủng P5-1 trong 5 ml môi trường Tryptic soy broth trong 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút ở 370C.
2. Hút 1,5-3 ml dịch huyền phù tế bào, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút 3. Loại bỏ dịch nổi phía trên, thu tế bào
4. Hòa tan tế bào trong 510 µl đệm TE pH 8,0 (50 mM Tris; 10mM EDTA, pH 8,0) 5. Bổ sung 60 µl dung dịch EDTA 0,5M; pH 8,0
6. Thêm 5µl dung dịch protease K có nồng độ 20 mg/ml trong đệm TE 7. Bổ sung 60 µl dung dịch có nồng độ 50 mg/ml trong đệm TE
8. Ủ hỗn hợp trên ở 650C trong 1-2 giờ
9. Sau đó, bổ sung 5µl protease K, 30µl SDS 10% (khối lượng/thể tích) 10. Thêm 110 µl dung dịch NaCl có nồng độ 5M và 90 µl dung dịch CTAB (CTAB 10%, NaCl 0,7 mM)
11. Chiết ngay lập tức với 0,7 ml dung dịch Chloroform : iso amyl alcohol (24:1) 12. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy pha trên cùng vào ống eppendorf mới
13. Chiết 3 lần với 0,7 ml phenol:chloroform:iso amyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ nhàng 20 phút/1lần chiết
14. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút và hút pha trên sang ống eppendorf mới
15. Kết tủa ADN tổng số với 500µl isopropyl alcohol ở -20oC trong 16-18 giờ 16. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút
17. Loại bỏ dịch trên, thu ADN tủa
18. Rửa ADN tủa 2 lần với 0,5 ml Ethanol 70% ở nhiệt độ phòng (250C), ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch
19. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ
20. Hòa tan tủa trong 40 µl đệm TE, pH 8,0; đảo nhẹ nhàng. Bảo quản ADN tổng số ở 40C.
2.4.7.2. Phương pháp PCR và giải trình tự gene 16S rRNA [10].
PCR là phản ứng trùng hợp, cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể lên hàng triệu lần nhờ sự xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt. Enzym này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao. Sự hoạt động của enzym được kiểm soát của một chu kỳ nhiệt xác định. Đoạn DNA được tổng hợp được giới hạn về mặt kích thước bởi một cặp mồi đặc hiệu. Cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu có trình tự là: 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')
và 1492R (5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’). Mồi được cung cấp bởi công ty Macrogen (Seoul, Hàn Quốc).
Thành phần phản ứng như sau: DNA template 1 µl H2O 11 µl dNTP (mỗi loại 0,2 mM) 0,8 µl Primer F 1 µl Primer R 1 µl MgCl2 1 µl Buffer 10x 4 µl Taq polymerase 0,2 µl Tổng thể tích 20 µl
Hỗn hợp phản ứng được chạy PCR với chương trình như sau:
940C 5 phút 940C 1 phút 30 giây Lặp lại 30 lần 510C 1 phút 30 giây 720C 2 phút 720C 10 phút 40C
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Sản phẩm sau khi giải trình tự được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI. Cây phát sinh chủng loại được thiết lập trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining.