Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5 Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn P5-1 bằng phương pháp sinh học phân tử
3.5.1. Kết quả tách DNA tổng số
Chủng xạ khuẩn P5-1 được nuôi trên môi trường Gause I (lỏng), ở nhiệt độ 28 0C, sau 48h thu sinh khối. Kết quả tách chiết được kiểm tra điện di trên gel agarose 1% được thể hiện trong hình 3.10
Hình 3.10. Kết quả điện di DNA tổng số của chủng xạ khuẩn P5-1 trên gel agarose 1%
DNA tổng số của chủng xạ khuẩn P5-1 được tách và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả điện di cho thấy đoạn DNA tổng số trên bản điện di xuất hiện là băng đơn, có kích thước rõ nét. Vì vậy DNA thu được qua quá trình tách chiết đã đạt yêu cầu để tiếp tục cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.2. Kết quả nhân gene mã hóa 16S-rRNA bằng phản ứng PCR
Để phân loại định tên chính xác chủng xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành nhân gene mã hóa 16S-rRNA để làm cơ sở phân tích trình tự. Đây là một gene chỉ thị được dùng phổ biến trong phân loại VSV. Cặp mồi được sử dụng để nhân gene là: 27F (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) và 1492R
(5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) Kết quả được thể hiện ở hình 3.11.
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen mã hóa 16S- rRNA chủng P5-1 trên gel agarose 1%
(Băng M: thang ADN chuẩn (kb); P5-1: Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen mã hóa 16S- rRNA.)
Từ kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao. Dựa vào thang ADN chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước gần 1,5kb tương ứng với kích thước khi chọn cặp mồi đặc hiệu. Do đó có thể xác định DNA được nhân lên chính là gen mã hóa 16S-rRNA của chủng P5-1. Kết quả này là cơ sở để tiến hành tách dòng giải trình tự và phân loại chủng xạ khuẩn này.
3.5.3. Kết quả giải trình tự gene mã hóa 16S-rRNA
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với gene mã hóa 16S-rRNA, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit PureLinkTM-DNA Purification (Invitrogen). Kết quả trình tự gene 16S- rRNA của chủng P5-1, chúng tôi đã giải được một đoạn gene.Trình tự gene này được sử dụng để Search blast trên GenBank để xác định các trình tự tương đồng, kết quả được thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả Search Blast các trình tự tương đồng gen 16S- rRNA của chủng P5-1 trên GenBank.
Từ kết quả Search Blast trên GenBank cho thấy chủng P5-1 có trình tự 16S- rRNA tương đồng cao với loài Streptomyces sp. HMU39 với tỉ lệ 99,86%. Dựa vào phần nềm Mega 6 chúng tôi đã xây dựng cây phân loại chủng P5-1, kết quả thể hiện ở hình 3.12. Qua đó cho thấy chủng P5-1 nằm trong cùng một nhóm với chủng
Hình 3.12. Cây phân loại của chủng P5-1 và một số chủng xạ khuẩn.
Như vậy khi kết hợp kết quả phân tích tình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng P5-1 với kết quả thu được khi nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng này, cho thấy chủng P5-1 thuộc chi Streptomyces sp và chúng tôi đặt tên chủng là
Streptomyces sp. P5-1. Đăng ký trình tự gen 16S- rRNA chủng P5-1 trên ngân hàng gen với mã số MK652886.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1. Với 39 mẫu đất được thu thập, sử dụng đồng thời hai môi trường NA và ISP-4 phân lập được 48 chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh trong tổng số 379 chủng được lựa chọn (chiếm 12,66%); tìm được 4/48 (8,33%) chủng xạ khuẩn phân lập ức chế sinh trưởng cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định, trong đó chủng P5-1 thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất.
2. Chủng P5-1 có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường Gause I, Gause II, ISP-1 và ISP-6. Khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn P5-1 trên môi trường Gause I ở 28oC sau 7 ngày nuôi cấy có hình tròn lồi, màu xám, mép hình răng cưa; khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ và tạo thành các vòng tròn đồng tâm bao bên ngoài; khuẩn ty cơ chất có màu nâu xám.
3. Chủng P5-1 sinh trưởng tốt trong các môi trường có D-glucose, succarose, mannitol, và lactose; phát hiện sinh trưởng ở pH 4-9 (pH thích hợp ở 7), 14-40oC (nhiệt độ thích hợp 30oC) và ở nồng độ NaCl 0-4% (nồng độ thích hợp ở 0-1%). 4. Gause I là môi trường tối ưu cho chủng P5-1 sinh tổng hợp hoạt chất kháng sinh
trong 7 ngày lên men.
5. Kháng sinh được tách chiết từ chủng P5-1 có khả năng ức chế sinh trưởng cả 4 chủng vi khuẩn kiểm định, cụ thể ức chế sinh trưởng chủng Bacillus subtilis
ATCC 6051 ở 1µg/ml, Bacillus anthracis KEMB 211-146 (4µg/ml),
Staphylococcus aureus ATCC 6538 (2µg/ml) và Staphylococcus epidermidis
ATCC 14990 (64 µg/ml).
6. Từ kết quả nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân tích trình tự gen 16S- rRNA đã phân loại được chủng P5-1 thuộc chi Streptomyces và đặt tên là
Streptomyces sp. P5-1. Mã số truy nhập gen 16S rRNA trên GenBank là MK652886.
2. ĐỀ NGHỊ
Cần tiền hành xác định loại kháng sinh được sinh ra từ chủng Streptomyces sp. P5-1 và đánh giá thử nghiệm về hiệu quả của kháng sinh trên vật nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
3. .
4. Vi Thị Đoan Chính, Trịnh Ngọc Hoàng, Trịnh Đình KháVi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội, Vũ Thị Lan (2007), Nghiên cứu sự phân bố của xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập từ đất Thái Nguyên. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc NCCB trong khoa học sự sống. Tr.433-437.
5. Nguyễn Lân Dũng (1983). Thực tập Vi sinh vật (Nguyễn Lân Dũng, Biên dịch), Hà Nội: NXB ĐH&THCN. (Quyển sách gốc được xuất bản năm 1976).
6. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III. NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội, Trang 101-109.
8. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006
9. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977). Vi sinh vật học, tập 2, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.
10.Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. (Luận văn thạc sĩ không xuất bản). Trường đại học Thái Nguyên, Việt Nam.
11.Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 3-48.
12.Đỗ Thu Hà (2002), Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng được phân lập từ đất tỉnh Quảng Nam, Tạp chí sinh học 24(1):59-63.
13. Nguyễn Đình Hải (2012), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12- Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường, Luận văn ThS ngành công nghệ Nano sinh học, Trường Đại học Công nghệ, Hà Nội.
14.Lê Thị Hiền, Đinh Văn Lợi, Vũ Thị Vân, Nguyễn Văn Giang (2014), Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn (Streptomyces sp.) đối kháng nấm bệnh cây, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2014, tập 12, số 5: 656-884.
15. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập tại Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội.
16.Phan Quốc Kinh (2004), Công nghiệp hóa chất, thông tin kinh tế & Công nghệ, số 1.
17.Dương Minh Lam, Đặng Ngọc Quang, Nguyễn Thị Hà (2013), Tách chiết, tinh sạch và nghiên cứu đặc điểm của kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces sp. QN63 chống Staphylococus aureus nhờn kháng sinh, tạp chí Khoa học và Công nghệ 51(5) 555-563.
18. Biền Văn Minh (2002), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm Hà Nội.
19.Lê Thị Thanh Xuân, Tăng Thị Chính (2007), Ảnh hưởng của các điều kiện lên men lên khả năng sinh chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum của hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 và Streptomyces hygroscopicus HD 58,
TIẾNG ANH
20.Alanis AJ (2005) Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?. Arch Med Res ;36:697–705.
21.Bungonsiri Intra, Isada Mungsuntisuk, Takuya Nihira, Yasuhiro Igarashi, ( 2011): Watanalai Panbangred, Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease
22.Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F (2008) Arthrobacter ardleyensis sp. nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment, Arch Microbiol, 183, pp. 301- 305.
23.Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2012) Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard—9th edition, CLSI document M07-A9 (ISBN 1-56238-783-9), vol. 32. Pennsylvania
24.Cornick M. M., McGuire J. M. L.(1962) Vancomycin and method for its preparation. US Patent 622264.
25.Crawford DL, Lynch JM, Whipps JM, Ousley MA (1993), “Isolation and characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen”, Applied and Environmental Microbiology, 59(3), pp. 899-905.
26.Das, S., Lyla, P. S., Khan, S. A. (2008), “Distribution and generic composition of culturable marine actinomycetes from the sediments of Indian continental slope of Bay of Bengal”, Chinese Journal Oceanology Limnology, 26, pp. 166- 177.
27.de Lima PRE, da Silvaa IR, Martinsa MK (2012) Antibiotics produced by Streptomyces. Braz J Infect Dis;16:466–71.
28.Doern GV, Pfaller MA, Erwin ME (1997). The prevalence of fluoroquinolone resistance among clinically significant respiratory tract isolates of Streptococcus pneumoniae in the United States and Canada- results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Diagn Microbiol Infec Dis. 1998;32:313–6.
29.Enright MC (2003). The evolution of a resistant pathogen-the case of MRSA. Curr Opin Pharmacol.;3:474–9.
30.George P. R. (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd, Springer, 1709 – 1712.
31.Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L (2004) Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 54, pp. 247-252. 32.Kamal Rai, Sujan Khadka, Bidya Shrestha (2018) Actinomycetes: Isolation,
Characterization and Screening for Antimicrobial Activity from Different Sites of Chitwan, Nepal. International Journal of Microbiology and Biotechnology. Vol. 3, No. 1, 2018, pp. 25-30. doi: 10.11648/j.ijmb.20180301.14.
33.Kekuda P, Shobha KS, Onkarappa R (2010) Fascinating diversity and potent biological activities of actinomycete metabolites. Pharm Res;3:250–6.
34.Keswanit J. and Whitman W.B. (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 – 678.
35.Krishnaraj M., Mathivanan N. (2009), “Antimicrobial potential of marine actinomycetes isolated from the Bay of Bengal” Envis centre newsletter, vol 7, issue 3.
36.Kuster, E. (1959). Outline of a comparative study of criteria used in characterization of the actinomycetes. Int Bull Bacteriol Nomencl Taxon 9, 97– 104.
37.Pridham, T. G. & Lyons, A. J. Jr (1961). Streptomyces albus (RossiDoria) Waksman et Henrici: taxonomic study of strains labeled Streptomyces albus. J Bacteriol 81, 431–441.
38.Shirling E.B., Gottlieb D. (1966) International of systematic bacteriology:
Method for characterization of Streptomyces species. Derpartment of Botany and Bacteriology Ohio Wesleyan University, Delaware, Ohio and Derpartment of Plant Pathology University of Illinois, Urbana, Illinois.
39.Song J.H (2004), “Surveillance of antimicrobial resistance – Strategic plan in Asia”. WPCID.
40.Stanley T. Williams M. E. Sharpe, J. G. Holt (1989). Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology, Williams & Wilkins, 4: 2452-2492.
41.Trerner, H.D, Buckus. E.J (1963), "System of color wheels for Streptomyces taxonomy" Appl. Microbiol, 11, 335-338.
42.Waskman, S.A., (1961) The actinomycetes. Classification, identification and descriptions of genera and species, vol 2, The William & Wilkins Co., Baltimore, USA.
43.WHO . Global strategy for containment of antimicrobial resistance. Geneva: WHO;CDS/CSR/DRS/2001(https://www.google.com/search?q=gg+d%E1%BB %8Bch&oq=gg&aqs=chrome.2.69i57j0j69i59l2j0l2.4617j0j7&sourceid=chrom e&ie=UTF-8)
PHỤ LỤC Trình tự đoạn gen 16S chủng P5-1: TCCGTCACGCGCGCTCTGGCCGTGTGCTTCACACACGCGTGTAGCGAGGTGAAGCCTT TCGTGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCT GGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGAC GGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGG GTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACA ATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTA AACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGC TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATT GGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAAC CCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCT GGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCT CTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATAC CCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTC GGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAA ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGAC GCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTG CCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCG GGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGA CGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACA ATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATT GGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTG CTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCCGTCACGTCACGAAAGTCG GTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGA CTGGCGATGGACAGTAAAAACGGGGGGGAAGAAAAGAGAAGA
Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện đề tài: A B P5-17 C D P5-1 K02-7 K05-26 N5 P5-1 P5-17 K02-7 N5 K05-26 P5-1 P5-1 K02-7 P5-17 K05-26 N5 K02-7 P5-17 K05-26
Lựa chọn chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh ức chế VSV kiểm định
Hỗn hợp dung môi etyl acetate- dịch xạ khuẩn Chiết dịch xạ khuẩn.
Máy cô quay chân không dịch xạ khuẩn Kháng sinh thô chủng P5-1.