Những yếu tố gây nhiễm vi sinh vật khi thu thậpIn vitro
Một số yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến nhiễm vi sinh vật nội sinh khi thu thập vật liệu trên đồng ruộng
- Những mô già thường nhiễm hơn mô non ( Bernstein va Carroll,1977)
- Mô nằm dưới đất như rễ, thân ngầm... mức độ nội sinh nhiễm cao hơn và cực kỳ khó làm sạch (Roy va Saha,1997)
- Mầm sinh dưỡng và mầm hoa thường chứa vi sinh vật trong mô hỗn hợp và nó được giữ ngay cả khi tẩy trùng bề mặt mô ( Merkle, 1997)
Nhiễm bẩn và bệnh cũng có thể do môi trường
- Những mô thu thập vùng nhiệt đới có độ ẩm cao tỷ lệ nhiễm cao hơn khu vực có nhiệt độ thấp và khô ( Pence,1999)
- Những loài sa mạc biểu hiện nhiễm nấm và vi khuẩn bề mặt ít hơn vùng khác và dễ làm sạch hơn những vùng ẩm độ cao (McKay ,1999).
- Những tác nhân nguy hiểm trong thu thập nuôi cấy mô (IVC) là Pseudomonas, Enterobacter, Agrobacterium, Xanthomoas, Flavobacterium và bacillus...Trong quá trình nuối cấy cần sử dụng một số chất kháng sinh.
Ví dụ: xử lý thuốc trừ vi khuẩn khi thu thập họ hành người ta thường sử dụng
Ciprofloxacin nồng độ 5 - 100mg/l, họ cam quýt sử dụng Ampicillin 100mg/l hoặc
Chloramphenicol 2,5mg/l, cà phê sử dụng Gentamycin 100mg/l... Thuốc trừ nấm khi thu thập cà phê sử dụng [(Butylamino) carbonyl]-1 H-benzimidazol - 2-yl] carbamic acid methyl 1 - 1,5g/l, thuốc lá 10 -50mg/l
2.5.4 Một số nghiên cứu thu thập nguồn gen bằng kỹ thuật In vitro
a) Thu thập nguồn gen cây chuối
Luz M. Montoya Hennao và cộng sự đã thực hiện và có kết quả thu thập In vitro với chuối. Chuối là một nguồn tài nguyên di truyền thực vật đang có nguy cơ xói mòn. Jaramillo,1983 chỉ ra rằng nguồn gen các giống và dạng hoang dại (Musa AA, BB, ABB, AAA và AAAB...) ngày càng ít và biến mất khỏi trung tâm đa dạng di truyền của loài cây này. Do vậy IPGRI đa có chương trình ưu tiên thu thập bảo tồn Ex situ bắt đầu từ năm 1983. Cây chuối là cây nhân giống vô tính bởi vì quả của nó không hạt (parthenocarpic) khi thu thập truyền thống là thu chồi mầm rất khó khăn và chi phí lớn . Phương pháp thu thập In vitro phu hợp hơn
Thu thập mầm cao 30 - 50 cm, loại bỏ các phần không cần thiết và các bẹ lá để được mầm dài 8 cm và đường kính 5 cm, khử trùng bề mặt mầm bằng chlorine 5,25% (sodium hypochlorite) trong 20 phút, rửa bằng nước tiệt trùng 5 phút, trong một số trường hợp có thể rửa bằng xà phòng hoặc nước rửa, tiếp theo ngâm trong dung dịch chống oxy hóa (ascobic acid 100mg/L) trong 10 phút. Sau đó giảm kích thước vật liệu bằng kìm và dao mổđến 4 - 5
cm để nuôi cấy In vitro. Khử trùng mô bằng cồn 70% và đưa mô vào môi trường MS ( Murashige và Skoog, 1962).
Bảng 2-7: Môi trường cho thu thập In vitro nguồn gen cây chuối AAA của cv Valery tại
CATIE, Costa Rica
Môi trường Thành phần
1( đ/c) MS, vitamin, sucrose, agar
2 MS, than hoạt tính, vitamin, sucrose, agar 3 MS, than hoạt tính, vitamin, sucrose, agar
benomyl, gentamycin
4 MS, vitamin, ampicillin, sucrose, agelrite
5 MS, vitamin, chloramphenicol, sucrose,
agelrite
Nguồn: Valerie C. Pence và cộng sự 2002
Môi trường bổ sung thêm vitamin, than hoạt tính (activated charcoal) 0,15%, thuốc trừ nấm và vi khuẩn phổ rộng (benomyl 100mg/L, gentamycin, 100mg/L ampicillin 100mg/L; chloramphenicol 100mg/L) nhưng nồng độ thấp tránh độc cho mô. Môi trường cũng có thêm đường sucrose 30g/L, Difco agar 7 g/L hoặc Gelrite 2 g/L
Cắt để giảm kích thước, trong điều kiện buồng di động nhưng đảm bảo khuất gió và phun ethanol và cồn 70% để khử trùng. Sau khi công việc thực địa hoàn tất, mô nuôi cấy đưa vào hộp, hộp đã phun cồn 70% khử trùng, chuyển đến phòng thí nghiệm di động nhiệt độ 26±1oC, độ ẩm 80%, ánh sáng 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối, cường độ ánh sáng 50µE m-2 s-1. Vệ sinh và kiểm tra khử trùng buồng nuôi cấy, dụng cụ, mô có thể sống 5 - 7 ngày sau khi cấy. Đánh giá mức độ hóa nâu của mô nuôi cấy theo thang điểm 0 - 3 như sau:
0 - không nâu
1-thỉnh thoảng có vết nâu 2-Hóa nâu trung gian 3- hóa nâu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả là sau 5 ngày nuôi cấy chỉ có môi trường 3 nhiễm nấm 20%, 7 ngày sau nuôi cấy môi trường 2 cũng nhiễm 20% vi khuẩn chỉ ra rằng nếu thời gian thu thập kéo dài hơn tỷ lệ nhiễm ngày càng cao. Có sự khác nhau về hóa nâu khi cắt bằng kìm và kéo, hóa nâu lớn hơn chỉ bằng kéo hay bằng tay. Các mẫu sống 100% và phụ thuộc vào kỹ thuật khử trùng bề mặt mô, không có sự sai khác có ý nghĩa với các môi trường khác nhau
b) Thu thập nguồn gen họ cam quýt (Abdenago Brenes Hines và cộng sự,2002)
Hạt là nguồn vật liệu chính, đơn giản và kinh tế nhất trong thu thập và bảo tồn nguồn gen cây trồng, trong trường hợp những loài cây nhân giống vô tính, hạt cứng có thể sử dụng kỹ thuật khác thay thế như In vitro (withers,1987). Họ cam quýt Citrus L. nhân giống vô tính sinh dưỡng bằng ghép, chiết hoặc giâm cành là phổ biến để giữ nguyên được kiểu gen, ngay cả trong trường hợp có hạt bình thường. Nhưng khả năng nảy mầm của hạt cam quýt bị suy giảm nhanh nếu độẩm giảm xuống dưới 70% và như vậy trong điều kiện nhiệt đới hạt mất sức nảy mầm nhanh và dẫn đến ngủ nghỉ. Phương pháp thay thế thu thập hạt là thu thập In vitro với các vi mô và hạt như một phương tiện thu thập, bảo tồn giá trị nguồn gen họ cam quýt.
Navarro(1984) nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô truyền thống với chi Citrus đã nêu ra kỹ thuật quan trọng được ứng dụng như sau: