Để bảo vệ mô cấy do nhiễm trở lại, tẩy trùng bề mặt mô và cấy vào môi trường thực hiện trong buồng vô trùng, khi cấy phải điều khiển nhiệt độ, chất lượng và cường độ ánh sáng, độ dài ánh sáng để mô sinh trưởng và phát triển tối ưu, môi trường dinh dưỡng cũng phải đảm bảo tối ưu cho mô sinh trưởng và phát triển. Dưới điều kiện đảm bảo mô ban đầu tạo ra nhiều đỉnh sinh trưởng bên và có thể chia ra để nhân tăng số lượng, điều kiện môi trường phù hợp một đỉnh sinh trưởng sẽ phát sinh rễ có thể trồng ra ngoài đất
Mô hình này áp dụng hệ thống không bất định, ví dụ có thể tạo ra một cây từ tiền đỉnh trong trường hợp các mô điểm hoặc phôi hợp tử. Từ những nuôi cấy này có thể tạo ra đỉnh de novo (phức hợp tổng hợp phân tử) ở hình thái bất định từ hầu hết các mô, cơ hội nâng cao khả năng nhân vô tính hỗn hợp trong thời gian ngắn, để bảo tồn di truyền hệ thống nhân vô tính không bất định là phù hợp. Nó không làm thay đổi di truyền do biến dị xô ma khi nuôi cấy mô tế bào. Như vậy, bất kỳ loại mô nào khi nhân đều tạo ra mô bất định sẽ bị loại bỏ. Nhà nghiên cứu phải dự tính được vấn đề này và có phương pháp tiến bộ mềm dẻo nhất đểứng dụng nuôi cấy In vitro như: mô lá có thể tạo ra cây qua phát sinh phôi xô ma; bầu nhụy qua nuôi cấy tạo phôi vô sinh và thụ phấn In vitro.
Một số vấn đề lưu ý khi ứng dụng phương pháp thu thập in vitro trên thực địa: - Thu thập In vitro là một hoạt động hỗ trợ và không đơn thuần là nhân giống
- Công việc trên thực địa ở mức giới hạn và chỉ thực hiện trong giai đoạn cần thiết và điều kiện không thuận lợi cho phương pháp khác.
- Lựa chọn phương pháp này thay cho phương khác để vượt qua một số giới hạn của công việc thực địa.
2.5.3 Hướng dẫn kỹ thuật của phương pháp
Chọn lọc mô phù hợp để nuôi cấy: vị trí tốt, mô khỏe, bề mặt mô sạch bệnh, mô trẻđang sinh trưởng là phù hợp để nó tiếp tục sinh trưởng trong In vitro
Cắt mô với kích thước phù hợp: hạn chế tôi đa hư hỏng bề mặt mô, nếu có thể loại bỏ những phần ngoài mô vì nó nhiễm bẩn, nhiễm bệnh hoặc bị tổn thương
Loại trừđất bám bẩn, sâu bệnh bằng nước: chú ý đôi khi tại thực địa không đủ nước để rửa, do vậy cần đem nước đi theo
Khử trùng bề mặt mô: nơi không đủ nước sạch để rửa có thể sử dụng thuốc tẩy trùng mang theo và tránh gây độc cho mô. Dung dịch tẩy không quy ước, có thể sử dụng nước sạch, thuốc trừ nấm nông nghiệp hoặc các thuốc tổng hợp nồng độ thấp. Tẩy trùng bề mặt tiếp theo thực hiện dưới điều kiện vô trùng, khử trùng và nuôi cấy trong lọ hoặc bình phù hợp hơn. Khử trùng bề mặt lặp lại một lần nữa khi đưa mẫu về đến phòng thí nghiệm cơ động, khử trùng tốt hơn là không sử dụng các chất hóa học khử trùng độc hại vì nó có thể
gây hại cho mô. Một thực tế là khi giữ nhiều mô phân sinh như vậy nên thu cả lá, lá bắc hay vỏ hạt để bảo vệ mô
Rửa nước tẩy và sâu bệnh trước khi cắt bỏ các phần không cần thiết: nước rửa phụ thuộc nồng độ và độc tố của sản phẩm sử dụng, đồng thời với kỹ thuật khử trùng cần cẩn thận loại bỏ nấm, vi khuẩn tiếp tục và ngăn tái nhiễm bẩn, nấm bệnh và vi khuẩn
Cắt bỏ những phần không cần thiết và phần hư hỏng: bước này cũng cần giữ gìn cẩn thận để quá trình cắt không gây bẩn và nhiễm bệnh đối với mô nuôi cấy
Cấy mô vào môi trường: cấy mô đã chuẩn bị vào môi trường đã có dinh dưỡng phù hợp và đậy nút. Bước này cần chú ý đến một số kỹ thuật như chọn lọc, ống nghiệm, số lượng mô nuôi cấy và môi trường nuối cấy
Dụng cụ và thiết bị: dung cụ như bình, lọ, ống nuôi cấy thuận lợi cho mang theo, có thể xách tay được, không quá nặng. Trong một số trường hợp sử dụng bình hoặc túi plastic phù hợp hơn vì nó mềm dẻo, nhẹ, dễ mang theo trong quá trình thu thập. Tuy nhiên những dụng cụ bằng chất dẻo, plastic phải đảm bảo phù hợp cho khử trùng làm sạch và ngăn cản nhiễm bẩn và nhiễm bệnh trong quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy phải thiết kế phù hợp với mục đích và mỗi loài cây. Nếu phát triển của mô phải có kích thích (kích thích nảy mầm của phôi, kích thích phát triển của trục mầm), môi trường nuôi cấy phải bổ sung các chất kích thích sinh trưởng phù hợp. Môi trường trong bảo tồn nguồn gen trái ngược với môi trường thu thập vì bảo tồn là giữ nguồn gen lâu dài, do vậy chất kích thích trong môi trưởng phải ở mức tối thiểu và phải cho thêm chất làm chậm sinh trưởng (retardant regulator) vào môi trường nuôi cấy. Môi trường tối thiểu cũng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Môi trường cũng có thể cho thêm các chất kháng sinh để làm chậm sinh trưởng và tránh ảnh hưởng của vi sinh vật và nấm. Môi trường lỏng thuận lợi cho nuôi cấy nhưng kém hiệu quả kìm hãm sinh trưởng của vi sinh vật. Dụng cụ đựng môi trường lỏng không được rò rỉ.
Chuyển mô nguồn gen vào tủủđịnh ôn: bước này kéo dài và nhiều rủi ro khi chuyển từ phòng này đến phòng khác trong phòng thí nghiệm. Bảo vệ vật liệu đã nuôi cấy trong khi vận chuyển, điều này liên quan đến cả môi trường và dụng cụ chứa, tránh lắc và thay đổi nhiệt độ trong quá trình vận chuyển, có thể sử dụng tủ lạnh trong quá trình vận chuyển tránh hư hỏng của vật liệu.
Những kỹ thuật khác khi thu thập nguồn gen In vitro trên đồng ruộng: Những kỹ thuật trên đã phân tích những yêu cầu nuôi cấy trong điều kiện hiện trường. Nhóm yếu tố thứ 2 cần xem xét là những yếu tố trái ngược với tự nhiên, mức độ thu thập In vitro và kinh nghiệm của cán bộ thu thập là vấn đề trọng tâm của cuộc thu thập.
Rất nhiều loài cùng được thu thập, do vậy áp dụng nhiều phương pháp khác nhau phù hợp cho mỗi loài, mỗi loài phải sử dụng các hỗ trợ thích hợp theo yêu cầu của loài. Phòng thí nghiệm cơđộng phải là phòng đa năng đáp ứng yêu cầu nêu trên. Thu thập In vitro yêu cầu cán bộ có kiến thức và phương pháp khoa học hơn là kinh nghiệm
Phương pháp cấy và trang thiết bị cũng phải phù hợp trên đồng ruộng và tính toán những thiết bị cần thiết nhất các điều kiện hỗ trợ và tiện nghi khác trên hiện trường hạn chếở mức tối thiểu. Những vấn đề cần quan tâm khác là xe để có thể chở các thiết bị cần thiết, nơi tập kết gần khu thu thập nhưng cũng gần những địa điểm có những dịch vụ tối thiểu như điện, nước để duy trì các nguồn gen trong In vitro trong điều kiện tối thiểu.
-Hộp đựng dụng cụ