1.1.2.3 Cấu tạo chung của cảm biến huỳnh quang sinh học và nguyên lý hoạt ng ng
Về mặt cấu tạo một cảm biến huỳnh quang sinh học cũng tuân theo cấu tạo cảm biến sinh học nói chung gồm 3 bộ phận chính: (1) phần tử nhận biết sinh học hay các đầu thu sinh học (biological recognition element hay bioreceptor) dùng để phân biệt các đối tƣợng cần nhận biết với sự có mặt của các hóa chất khác nhau.
Chồng chập
Dập tắt huỳnh quang Truyền năng lượng
Dập tắt huỳnh quang do va chạm
(2) phần tử chuyển đổi quang học (transducer) đóng vai trò chuyển đổi tín hiệu sinh học thành một tín hiệu quang có thể đo lƣờng (3) phần tử thu và xử lý tín hiệu.
Nguyên lý hoạt động của cảm biến huỳnh quang sinh học dựa trên việc chuyển đổi tín hiệu thu đƣợc từ chất phân tích thành các tính hiệu quang có thể đo đƣợc, trong trƣờng hợp này là phổ huỳnh quang. Đầu thu sinh học có thể là enzyme, các kháng nguyên – kháng thể, DNA hay các hát nano kim loại . Phần tử chuyển đổi tín hiệu ở đấy chính là các tâm phát quang hay vật liệu phát huỳnh quang, còn bộ phận thu và xử lý số liệu là hệ thộng điện tử kết hợp dẫn và phân tích ánh sáng, ví dụ nhƣ hệ thống máy tính kết hợp máy quang phổ.
Khi các phân tử của chất phân tích tƣơng tác với cảm biến, phổ huỳnh quang của các tâm phát quang thuộc phần tử chuyển đổi quang học cũng bị thay đổi thông qua các phản ứng xúc tác, sự thay đổi hình dạng phân tử, sự truyền năng lƣợng huỳnh quang cộng hƣởng, hình thành phức chất hay sự dập tắp huỳnh quang do va chạm [33][22][13].
1.1.2.3.1 Hoạt ng dựa trên xúc tác và hoạt ng dựa phát hiện liên kết
Cảm biến huỳnh quang sinh học có thể phân loại dựa trên hai có chế hoạt động khác nhau đó là cơ chế xúc tác và cơ chế hình thành liên kết.
Trong cơ chế xúc tác, tƣơng tác giữa chất phân tích các chất xúc tác nhƣ là enzyme hoặc chất xúc tác vô cơ có thể đƣợc phát hiện thông qua phát hiện các chất sản ph m trong phản ứng xúc tác. Các sản ph m này sẽ tƣơng tác với tâm phát quang gây ra sự thay đổi phổ huỳnh quang của các tâm phát quang. Sự thay đổi của phổ huỳnh quang tỷ lệ với nồng độ của chất phân tích [33][22] [13].
Trong khi đó, cảm biến hoạt động dựa trên sự hình thành liên kết phát hiện liên kết giữa các chất với nhau trong quá trình cảm biến. Sự liên kết này có thể là liên kết hóa học, hoặc cũng có thể là liên kết ái lực làm thay đổi đặc trƣng của các phân tử nhận biết sinh học nhƣ là tính phân cực, hình dạng từ đó là thay đổi tính
phân cực của môi trƣờng xung quanh các tâm phát quang và làm thay đổi phổ huỳnh quang của các tâm phát quang [33] [22].
1.1.2.3.2 Vật liệu cấu trúc nano ứng dụng trong cảm biến huỳnh quang sinh học. học.
Việc sử dụng tính chất phát huỳnh quang của vật liêu nano trong cảm biến huỳnh quang sinh học ngày càng đƣợc chú ý theo sau sự phát triển của công nghệ nano. Có vật liệu cấu trúc nano thƣờng có tính chất quang học đặc biệt nhƣ có thể phát quang cƣờng độ cao, và có độ bền quang học tốt. Một số vật liệu cấu trúc nano có thể không tƣơng thích sinh học có thể đƣợc chức năng hóa đế tăng khả năng tƣơng thích. Ngoài ra, các cảm biến sinh học sử dụng vật liệu nano còn có tận dụng những đặc tính ƣu việt tính chất hóa học, sinh học, vật lý có đƣợc nhờ cấu truc nano của vật liệu so với cấu trúc khối. Các cấu trúc nano thƣờng có các hiệu ứng bề mặt dựa trên kích thƣớc nhỏ, cấu trúc bề mặt, sự truyện dẫn điện tích, mức độ dính ƣớt, tỷ số diện tích bề mặt, trên thể tích đƣợc tận dụng trong nghiên cứu cảm biến [82][33][22]. Đối với cảm biến sinh học huỳnh quang, các đặc tính ƣu việt của các tâm phát quang vật liệu cấu trúc nano nhƣ các hạt nano bán dẫn, hạt nano silica, cum nano kim loại vàng/ bạc, vật liệu liệu nano oxit kim loại là khả năng phát huỳnh quang cƣờng độ cao, độ bền quang học, tính tƣơng thích quang học khi so sánh với các tâm phát quang hữu cơ, hay protein sinh học. Việc sử dụng các cấu trúc carbon nhƣ là chấm, ống nano, hay graphen trong các cảm biến sinh học phát hiện tế bào ung thƣ, tƣơng tác của DNA, phân tử glucose cũng đã đƣợc rất nhiều các nhóm trên thế giới nghiên cứu [79][53][4][3] Bên cạnh các cấu trúc nano của các loại vật liệu nói trên, cấu trúc nano của oxit kim loại, cụ thể là ZnO, cũng đƣợc nghiên cứu sử dụng rất nhiều trong các loại cảm biến huỳnh quang sinh học bởi các tính chất hấp dẫn khi là vật liệu bán dẫn loại n có độ rộng vùng cấm rộng (3.37 eV), điểm đẳng điện cao (pI = 9-9.5) và đặc biệt là khả năng phát huỳnh quang rất mạnh ở nhiệt độ phòng cùng tính tƣơng thích sinh học cao. Tận dụng đặc trƣng của vật liệu ZnO, nhiều cảm biến sinh học đã đƣợc phát triển dựa trên loại vật liệu này. Đồng thời cấu trúc nano ZnO còn có thể kết hợp với các
loại nano kim loại để tăng cƣờng khả năng cảm biến khi phát triển các loại cảm biến sinh học là một hƣớng nghiên cứu rất hứa hẹn trong việc tăng cƣờng độ nhạy cũng nhƣ làm giảm giới hạn phát hiện của cảm biến [82][44][26][30].
1.2 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐO HÀM LƢỢNG GLUCOSE
Cảm biến glucose đầu tiên đƣợc phát minh bởi LeyLand C.Clark vào năm 1962, đồng thời mở ra một hƣớng nghiên cứu về các loại cảm biến sinh học [16]. Trải qua thời gian, nhiều cảm biến sinh học đo hàm lƣợng đƣờng glucose đã đƣợc phát triển và hoàn thiện bằng cách thay đổi phƣơng pháp nhận biết phân tử gluose nhƣ enzyme, các protein hoặc vật liệu nano [85], phƣơng pháp chuyển đổi tín hiệu sinh học có thể là chỉ thị màu, điện hóa hoặc quang học; kĩ thuật thu, xử lý tín hiêu và hiển thị kết quả [16][51][86] [85][82].
1.2.1. Cảm biến glucose bằng phƣơng ph p iện hóa
Trƣớc khi phát minh ra cảm biến glucose, Leland C. Clark đã phát minh ra điện cực có thể đo đƣợc nồng độ oxy khuếch tán trong dung dịch gọi là điện cực Clark năm 1949[16]. Điện cực này gồm một bản catot platin với điện thế âm so với điện cực Ag/AgCl. Sau đó điện cực này đƣợc sử dụng kết hợp với enzyme glucose oxdase GOD – GOx với mục đích đo nồng độ glucose thông qua đo lƣợng oxygen tiêu thụ trong phản ứng oxi hóa glucose theo các phƣơng trình sau [16].
(1.1)
(1.2)
(1.3)
Trong đó flavin adenine dinucple dinucleotied – FAD là tâm oxi hóa nằm enzyme GOx và bị bao quanh bởi một lớp protein mỏng glucoprotein.
Cảm biến điện hóa hoạt động dựa trên đo sự tiêu thụ oxy đƣợc chế tạo và phát hành thƣơng mại lần đầu năm 1975. Tuy nhiên loại cảm biến này có một vấn đề, đó là sự phụ thuộc vào nồng độ oxy trong môi trƣờng dẫn tới sự ra đời của cảm
biến glucose bằng phƣơng pháp xác định trực tiếp nồng độ H2O2 – sản ph m trong phản ứng ôxi hóa theo phƣơng trình:
(1.5)
Trong cảm biến điện hóa đo nồng độ H2O2 này, điện cực dƣơng platin ở điện
thế +0.6V so với điện cực Ag/AgCl.
Kể từ đó, cảm biến glucose có sự hoàn thiện dần. Trong khi, ở thế hệ đầu tiên của cảm biến, oxi đƣợc dùng là chất oxi hóa thì ở cảm biến thế hệ II, các electron chuyển tiếp một lần nữa qua các dung môi điện hóa trƣớc khi đi về phía điện cực. Các loại dung môi điện hóa này có thể là ferrocence, ferricyanide, quinines hay xanh methylene; bên cạnh hỗ trợ cho quá trình chuyển đổi điện tử còn giúp làm tăng độ nhạy của cảm biến [14][20][74]. Cảm biến thế hệ II đã loại bỏ đƣợc nhƣợc điểm của thế hệ I thông qua việc đơn gản hóa quá trình chuyển tiếp điện tử tới bề mặt chuyển tiếp, nhƣng vẫn cần phải bổ xung thêm dung môi điện hóa trong mỗi một lần đo. Cảm biến thế hệ III với mong muốn đơn giản hóa quá trình pha thêm dung môi, chuyển tiếp trực tiếp điện tử tới bề mặt điện cực thông qua tiếp xúc giữa enzyme oxi hóa khử – GOx, với vật liệu làm điện cực [13][14][20][86].
Thế hệ I
Thế Hệ III
Hình 1.7: Sự thay đổi cấu trúc và cơ chế hoạt động của cảm biến điện hóa glucose qua các thế hệ.
Nhƣ vậy, phần tử chuyển đổi tín hiệu trong cảm biến sinh học thế hệ II là các dung môi điện hóa và trong cả biến sinh học thế hệ III là vật liệu làm điện cực. Nếu nhƣ việc hòa tan thêm dung môi điện hóa để làm tăng quá trình chuyển hóa điện tử đƣợc cho là phức tạp, thì sự có mặt của dung môi cũng làm loãng đi các ion vi lƣợng có từ mẫu ph m. Các ion dung môi hữu cơ có tính tƣơng thích tốt với các phân tử enzyme trở thành ƣu điểm của cảm biến thế hệ II so với cảm biến thế hệ III. Trong khi đó, tƣơng thích sinh học giứa vật liệu điện cực với các enzyme vẫn luôn là thách thức rất lớn đối với các vật liệu mới nhằm ứng dụng trong chế tạo cảm biến sinh học thế hệ III. Vì vậy các nghiên cứu về cảm biến sinh học sử dụng tƣơng tác enzyme oxi hóa khử với cơ chất hiện nay vẫn xuất hiện đồng thời cả hai loại cảm biến thế hệ II và III [14][20][83].
Cảm biến sinh học glucose bằng phƣơng pháp điện hóa có ƣu điểm là thời gian phản hồi nhanh và vùng nồng độ cảm biến rộng tuy nhiên vẫn chịu ảnh hƣởng bởi các nhiễu điện từ có trong mẫu [83]. Nhƣợc điểm đó dẫn tới một hƣớng
(oxi hóa)
phát triển khác của cảm biến glucose dựa trên phƣơng pháp huỳnh quang hay còn đƣợc gọi là cảm biến huỳnh quang đo hàm lƣợng glucose.
1.2.2 Cảm biến glucose bằng phƣơng ph p huỳnh quang
Cảm biến huỳnh quang đƣợc xem là một hƣớng nghiên cứu cảm biến glucose nhằm khắc phục nhƣợc điểm của cảm biến điện hóa nhƣ giảm ảnh hƣởng từ các nhiễu điện từ trong mẫu, đồng thời hứa hẹn tăng cƣờng độ nhạy, cũng nhƣ độ chọn lọc khi đo hàm lƣợng glucose[22][47].
1.2.2.1 Nguyên lý hoạt ng của cảm biến glucose huỳnh quang
Nguyên lý hoạt động của cảm biến glucose huỳnh quang cũng tƣơng tự nhƣ cảm biến huỳnh quang sinh học nói chung là chuyển đổi tín hiệu từ các phân tử glucose thành tín hiệu huỳnh quang với cấu tạo gồm ba phần : (1) phần tử nhận biết glucose, (2) bộ ph n chuyển đổi tín hiệu, (3) bộ phận thu, xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả.
Bộ phận chuyển đổi tín hiệu từ glucose thành tín hiệu huỳnh quang là các tâm phát quang gồm các chất màu nhạy môi trƣờng protein [48][71], hay vật liệu nano nhƣ chấm lƣợng tử , vật liêu nano cacbon, hạt nano silica, vật vật liệu nano bán dẫn, kim loại [22][58][88][79]….Sự có mặt của chất phân tích có thể làm thay đổi cƣờng độ đỉnh huỳnh quang, làm dịch chuyển đỉnh hoặc làm thay đổi thời gian sống trong sự phát huỳnh quang của của các tâm phát quang.
Trong khi các tâm phát quang là chất màu và protein có nhƣợc điểm là độ bền quang học thấp [22][47], hay kích thƣớc phân tử lớn ảnh hƣởng đến phân bố của các phân từ nhận biết thì vật liệu nano lại nổi lên nhƣ một ứng cử viên thay thế với khả năng phát huỳnh quang tốt, độ bền quang học và linh động trong việc chức năng hóa bề mặt [82][22].
Cơ chế cảm biến glucose bao gồm dựa trên phát hiện liên kết với glucose hoặc dựa phản ứng oxy hóa glucose.
Cơ chế dựa trên phát hiện liên kết với glucose
Trong cơ chế cảm biến dựa trên sự hình thành liên kết với glucose yêu cầu sử dụng các chất nhƣ là Concanavalin A – Con A, Protetin liên kết glucose – GBP, boronic acid. Con A đóng vai trò nhƣ là đầu thu – receptor liên kết donnor là các tâm phát quang với các chất dập tắt – quencher khi không có glucose làm dập tắt huỳnh quang của các tâm phát quang thông qua sự truyền năng lƣợng huỳnh quang FRET. Khi có măt các phân tử glucose, các phân tử này sẽ nhanh chóng liên kết với ConA thay thế các quencher từ đó làm tăng cƣờng huỳnh quang của các tâm phát quang [22]. Tuy nhiên, việc sử dụng conA có nhƣợc điểm là chúng có độc tính có thể gây hại [22][41].
Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của cảm biến huỳnh quang sinh học glucose dựa trên FRET [22].
GBP, Boronic axid đƣợc sử dụng nhƣ một đầu thu chất liên kết glucose với tâm phát quang. Khi xuất hiện liện kết giữa glucose, GBP và Boronic acid sẽ thay đổi hình dáng phân tử từ đó thay đổi phân cực của môi trƣờng và làm thay đổi cƣờng độ huỳnh quang của các tâm phát quang.Việc sử dụng bornic acid có nhƣợc điểm là độ chọn lọc không cao và cực kỳ nhạy với thay đổi pH của môi trƣờng [22].
1.2.2.1.2 Cơ chế dựa trên sự oxi hóa glucose
Trong cơ chế này, glucose bị oxi hóa thông qua các phản ứng xúc tác sinh ra
hiện thông qua xác định lƣợng sản ph m tạo ra hoặc sự thay đổi của pH do phản ứng. Những tác nhân trên sẽ làm thay đổi sự phát huỳnh quang của các tâm phát quang từ đó ta có thể xác định hàm lƣợng glucose thông qua xác định sự thay đổi huỳnh quang của các tâm phát quang.
Chất xúc tác thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình oxi hóa glucose là enzyme GOx bởi độ chọn lọc cao với phân tử glucose, cũng nhƣ tính ổn định khi so sánh với các loại enzyme khác. Cảm biến glucose hoạt động dựa theo theo dõi sƣ thay đổi độ pH của dung dịch sử dụng các chất màu nhạy với sự thay đổi nồng độ ion H+ trong môi trƣờng làm tâm phát quang. Cụ thể, sự phát huỳnh quang của các chất màu này bị thay đổi cƣờng độ khi pH thay đổi. Từ đó việc xác định nồng độ glucose đƣợc xác định thông qua sự thay đổi cƣờng độ phát huỳnh quang [33]