STT Dụng cụ và thiết bị Mục đích sử dụng
1 Nồi chưng cất lôi cuốn hơi nước (10 Lít) Chiết tinh dầu 2 Tủ sấy 101-1 ASB, Trung Quốc Sấy mẫu
3 Dụng cụ thuỷ tinh Pha chế dung dịch
4 Phễu chiết Chiết tinh dầu
5 Cân phân tích (Shimazu, Nhật) Cân hoá chất 6 Thiết bị kính hiển vi điện tử quét
(SEM, Hitachi S-4800)
Cấu trúc hình thái pectin, xenlulozo
7 Máy khuấy từ gia nhiệt Đun khuấy mẫu 8 Phổ hồng ngoại phản xạ FTIR
(Spectrum Two, Perkin Elmer)
Xác định các nhóm chức của các chất
25
2.2 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu
Vỏ bưởi, phế liệu bưởi thu lượm tại các hộ gia đình sinh sống trên địa bàn Hà Nội. Vỏ bưởi được tách riêng phần vỏ xanh và phần cùi trắng. Phần vỏ xanh được cắt nhỏ, rửa sạch, để ráo nước và tiến hành quá trình chưng cất tinh dầu. Phần cùi trắng được rửa sạch, xay nhỏ và sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 40 °C đến khối lượng không đổi.
2.2.2 Quy trình tách tinh dầu từ vỏ bưởi bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước nước
Quy trình tách tinh dầu từ vỏ bưởi bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được thực hiện như sau:
- Xử lý sơ bộ nguyên liệu: Vỏ bưởi được thu gom từ các hộ gia đình, rửa sạch, tách phần vỏ xanh và cùi trắng. Vỏ xanh được cắt nhỏ để các tế bào chứa tinh dầu dễ vỡ hơn và tiết kiệm thời gian chưng cất. Cân một lượng xác định vỏ bưởi và cho lên giá đỡ cùng 2 Lít nước cất vào nồi chưng cất.
- Bật máy bơm để khởi động bộ phận làm lạnh và đảm bảo máy bơm phải để ngập nước
- Bật bếp và tiến hành chưng cất ở 90 °C trong 1,5 giờ.
- Sản phẩm thu được là hỗn hợp gồm tinh dầu và nước. Cho hỗn hợp vào bình chiết và được giữ yên trong khoảng 15 phút nhằm loại cặn trong dầu thô. Sử dụng
Nước đầu vào Tinh dầu bưởi và
nước Bộ phận làm lạnh Vỏ bưởi Nước đi ra Bếp đun
26
Na2SO4 để làm khan và loại bỏ hoàn toàn nước trong tinh dầu. Gạn lấy lớp sản phẩm bên trên là tinh dầu thành phẩm.
* Phương pháp GC-MS phân tích thành phần tinh dầu
Thành phần của tinh dầu bưởi được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí- khối phổ (GC-MS) trên thiết bị 456-GC-MS. Phân tích GC được thực hiện trên cột mao quản Rtx-5MS (30 m × 0,25 mm x 0,50 mm). Chương trình đo nhiệt độ là 3 phút ở 50 °C, sau đó tăng lên 120 °C với tốc độ gia nhiệt 5 °C/phút giữ trong 1 phút, và tăng tiếp lên 280 oC và giữ ở 280 °C trong 3 phút tốc độ gia nhiệt 20 ℃/phút. Lưu lượng khí mang Heli 1,2 mL/phút, và tỷ lệ chia dòng là 1:9. MS hoạt động với năng lượng ion hóa 70 eV. Nhiệt độ của nguồn ion được giữ ở 250 °C. Phạm vi khối lượng được quét từ 18 đến 600 amu. Mỗi hợp chất được xác định bởi so sánh phổ khối lượng thu được với phổ khối lượng tham chiếu từ Viện Tiêu chuẩn và Công nghệ Quốc gia (NIST). Chuẩn hóa diện tích mỗi đỉnh thu được để tính toán tỷ lệ phần trăm gốc của các thành phần trong tinh dầu bưởi.
2.2.3 Quy trình tách pectin và xenlulozo bằng axit
Lấy 100 g vỏ bưởi tươi đã sấy khô đến khối lượng không đổi vào 300 mL axit citric (0,01 M) (pH = 2). Đun khuấy từ ở 70 – 80 °C trong 60 phút. Sau đó, đem lọc hút chân không (sử dụng giấy lọc băng xanh) thu được phần dịch và bã.
- Phần dịch: Làm lạnh đến 4°C, sau đó đổ Etanol (đã làm lạnh) vào với tỉ lệ thể tích: Vetanol/Vdịch = 1,5 để xuất hiện kết tủa, để hỗn hợp lạnh trong 30 phút, sau đó, đem lọc tách lấy kết tủa, sấy kết tủa ở 40°C, thu được pectin dạng rắn.
- Phần bã
Bước 1: Kiềm hóa: cho phần bã trên vào 100 mL dung dịch NaOH 1,0 M đun ở 90 °C trong 60 phút để hòa tan hemixenlulozo và lignin. Phần bã sau đó được đem lọc rửa lại bằng nước ấm ở 70oC đến khi pH=7.
Bước 2: Axit hóa: sau khi kiềm hóa xong, đem phần bã vừa rửa vào 100 mL HNO3 1,25 M, đun ở 90°C trong 90 phút để hòa tan thêm hemixenlolozo và phần pectin còn lại. Sau đó, đem lọc rửa phần bã thu được bằng nước ấm, đến khi pH=7, sấy phần bã ở 60°C, thu được xenlulozo [22].
27
2.2.4 Các yếu tố khảo sát, đánh giá hiệu quả tách pectin
2.2.4.1 Khảo sát loại axit sử dụng làm dung môi tách pectin
Pectin được tách chiết bằng một trong hai loại axit: axit citric và axit nitric ở pH = 2, nhiệt độ 70 – 80 °C trong thời gian 90 phút. Dịch lọc thu được đem kết tủa lạnh bằng cồn để thu được pectin. Lựa chọn loại axit ngâm chiết bằng cách so sánh mức độ tan trong nước của hai loại pectin tách được từ hai loại axit trên.
2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm axit đến hiệu suất tách pectin từ cùi bưởi.
Ngâm cùi bưởi với nhiệt độ từ 70 - 80°C trong thời gian khảo sát từ 50 – 100 phút với axit lựa chọn ở pH xác định.
2.2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch axit đến hiệu suất tách pectin từ cùi bưởi.
Dung dịch axit lựa chọn với các pH khác nhau từ 1 đến 3 được sử dụng để ngâm chiết pectin trong khoảng thời gian xác định với nhiệt độ 70 – 80°C.
Hiệu suất tách pectin được xác định theo công thức: HPectin (%) = 𝑚𝑃
𝑚𝑜× 100 %
Trong đó: mP là khối lượng Pectin thô thu được (g) mo là khối lượng cùi bưởi được sấy khô (g)
2.2.5. Đánh giá đặc trưng hình thái, cấu trúc pectin
2.2.5.1 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope)
Cấu trúc hình thái của pectin được đánh giá qua ảnh chụp hiển vi điện tử quét (SEM). Bề mặt mẫu pectin cần được phun phủ một lớp Pt (dày khoảng 5 nm) trước khi chụp. Phép đo được thực hiện trên thiết bị FE-SEM (Hitachi S-4800), Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nguyên lý: Chùm điện tử hẹp được quét trên bề mặt mẫu, các electron va chạm
với bề mặt mẫu tạo ra các electron thứ cấp đi tới detector và chuyển thành tín hiệu điện, các tín hiệu này được khuếch đại đi tới ống tia catot và quét lên ảnh, thể hiện hình thái cấu trúc vật liệu.
28
2.2.5.2 Ảnh phổ hồng ngoại (FTIR)
Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR) đo cường độ hấp thụ bức xạ hồng ngoại của mẫu vật liệu, dựa trên nguyên tắc hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại của phân tử. Khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại, các chuyển động dao động và chuyển động quay của phân tử bị kích thích với các tần số khác nhau, thu được dải phổ hấp thụ hồng ngoại. Các nhóm định chức khác nhau hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở các tần số khác nhau tương ứng với bản chất hóa học của chúng. Dựa vào phổ hồng ngoại có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử của pectin.
Cách đo: Các mẫu được sấy khô ở 45 °C để loại bỏ hết ẩm. Mẫu dạng bột được trộn với bột KBr, sau đúc thành viên hình trụ dẹt có độ dày 1nm và đưa vào máy FTIR. Phổ FTIR được ghi lại trên máy quang phổ Spectrum Two, với 32 lần quét và độ phân giải 4 cm-1 trong dải số sóng 400-4000 cm-1. Các phép đo được thực hiện trên thiết bị FTIR (Spectrum Two, Perkin Elmer), đo tại trường Học viện kỹ thuật Quân sự.
2.2.5.3 Xác định khối lượng phân tử của pectin bằng phương pháp đo độ nhớt
Chuẩn bị các mẫu dung dịch pectin với các nồng độ khác nhau: 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 g/L bằng cách hòa tan lượng cân chính xác 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 g pectin trong dung dịch NaCl 0,1 M, để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ nhằm tạo dung dịch đồng nhất.
Tiến hành đo: Khuấy đều dung dịch của các mẫu 10 phút trước khi đo. Các dung dịch mẫu pectin đã hòa tan hoàn toàn được đổ vào mao quản của nhớt kế và tiến hành đo thời gian chảy. Khi mà điều kiện đo như dung môi và nhiệt độ được cố định thì độ nhớt đặc trưng chỉ phụ thuộc vào khối lượng phân tử. Mối quan hệ giữa độ nhớt đặc trưng và khối lượng phân tử được thể hiện trong phương trình Mark- Houwink: η = KMα
Trong đó: K, α là các hằng số tùy theo mỗi loại polyme M là khối lượng phân tử polyme (g/mol)
Tại 25ºC và dung môi sử dụng là dung dịch NaCl 0,1 M thì K và α của pectin tương ứng là: (1,4 x 10-6) và 1,43 [26].
29
2.2.5.4 Phương pháp xác định độ ester hóa (DE) của Pectin
Chỉ số ester hóa thể hiện mức độ ester hóa của pectin, là phần trăm số lượng các gốc axit galacturonic được ester hóa trên tổng số lượng gốc axit galacturonic có trong phân tử.
Độ ester hóa của pectin được xác định theo phương pháp của Pinheiro và cộng sự (2008). Cho 0,5 g pectin vào 5 mL etanol, 1,0 g NaCl, 1-2 giọt phenolphthalein và thêm 100 mL nước cất ấm. Hỗn hợp được chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1 N thu được thể tích V1 (mL). Sau đó, thêm 25 mL dung dịch NaOH 0,25 N vào và khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Tiếp đó, cho thêm 25 mL dung dịch HCl 0,25 N và lắc cho đến khi mất màu hồng. Hỗn hợp được chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1 N và thu được thể tích V2 (mL) [23]
Độ ester được tính theo công thức:
DE (%) = 𝑉2
𝑉1+𝑉2× 100 %
2.2.4.5 Phương pháp xác định độ tinh khiết của Pectin
Độ tinh khiết của pectin được xác định bằng phương pháp kết tủa canxi pectat [24]. Cho 0,15 g pectin thô vào 100 mL dung dịch NaOH 0,1 N. Để hỗn hợp trong 7 giờ cho pectin bị xà phòng hóa hoàn toàn thành axit pectic. Thêm 50 mL dung dịch axit axetic 1 N và sau 5 phút thêm 50 mL CaCl2 1 N rồi để yên 1 giờ, tiếp đó, đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tan đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi. Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clo nữa (thử nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1 %). Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105 oC cho tới khối lượng không đổi [25].
Độ tinh khiết của pectin (P) được tính theo công thức sau: P (%) = 𝑚 × 0,92 × 100 %𝑀
Trong đó: m (g): Khối lượng của kết tủa canxi pectat (g) M (g): Khối lượng pectin thô (g)
30
2.2.6 Các yếu tố khảo sát, đánh giá hiệu quả tách xenlulozo
2.2.6.1 Khảo sát loại axit sử dụng làm dung môi tách xenlulozo
Phần bã thu được từ quy trình đun khuấy axit được tiếp tục đun trong kiềm ở nhiệt độ 90 °Ctrong 60 phút, sau đó, đem tách chiết bằng một trong hai loại axit: axit citric và axit nitric ở cùng nồng độ (1,25 M), nhiệt độ 90°Ctrong thời gian 90 phút.
2.2.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm axit đến hiệu suất tách xenlulozo từ cùi bưởi.
Ngâm phần bã sau kiềm hóa bằng axit đã lựa chọn với nồng độ xác định (1,25 M), nhiệt độ 90°C trong thời gian khảo sát từ 50 – 100 phút.
2.2.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ axit đến hiệu suất tách xenlulozo từ cùi bưởi.
Ngâm phần bã sau kiềm hóa bằng axit đã lựa chọn với nồng độ khảo sát từ 0,5 – 1,5 M trong khoảng thời gian xác định ở nhiệt độ 90°C.
Hiệu suất tách xenlulozo được xác định theo công thức: HPectin (%) = 𝑚𝑋
𝑚𝑜 × 100 %
Trong đó: mX là khối lượng xenlulozo thô thu được (g) mo là khối lượng cùi bưởi được sấy khô (g)
2.2.7 Đánh giá đặc trưng hình thái, cấu trúc xenlulozo
2.2.7.1 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét SEM (Scanning Electron Microscope)
Cấu trúc hình thái của xenlulozo được đánh giá qua ảnh chụp hiển vi điện tử quét (SEM). Bề mặt mẫu xenlulozo cần được phun phủ một lớp Pt (dày khoảng 5 nm) trước khi chụp. Phép đo được thực hiện trên thiết bị FE-SEM (Hitachi S-4800), Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.7.2 Phương pháp phổ hồng ngoại (FTIR)
Các phép đo được thực hiện trên thiết bị FTIR (Spectrum Two, Perkin Elmer), đo tại trường Học viện kỹ thuật Quân sự.
31
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân tích thành phần hoá học của tinh dầu vỏ bưởi.
Tinh dầu vỏ bưởi sau khi được tách bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và được làm khan bằng Na2SO4 được đem xác định thành phần hóa học các chất trong đó bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS. Kết quả đo được được thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu thu được từ vỏ bưởi
STT Thành phần Tỉ lệ thành phần hoá học
các chất trong tinh dầu vỏ bưởi (%)
1 β-Pinen 1,744
2 3-Caren 3,540
3 α-Phellandren 3,036
4 d-Limonen 91,680
Như vậy, tinh dầu vỏ bưởi có chứa 4 loại hợp chất, trong đó, d-Limonen chiếm hàm lượng cao nhất (91,680 %), ngoài ra, còn có các hợp chất khác như β-Pinen (1,744 %), 3-Caren (3,540 %) và α-Phellandren (33,036 %). Kết quả này cho thấy không có khác biệt đáng kể về hàm lượng Limonen so với các công bố trước đây của tác giả Huỳnh Xuân Phong và các cộng sự (2021) [6], tuy nhiên, tinh dầu vỏ bưởi khóa luận thu được có chứa ít thành phần hơn, điều này chứng tỏ tinh dầu không lẫn quá nhiều tạp chất và có độ tinh khiết cao hơn.
32
Hình 3.1: Ảnh phổ GC-MS của tinh dầu bưởi.
3.2 Khảo sát loại axit sử dụng trong quá trình tách pectin
Trong quá trình tách pectin, yếu tố ảnh hưởng quan trọng đến hiệu suất tách là loại axit dùng để chiết, pH dung dịch axit, nhiệt độ và thời gian đun khuấy. Mỗi loại axit chiết khác nhau cho hiệu suất thu hồi pectin khác nhau. Thí nghiệm được chia thành hai giai đoạn: hòa tan pectin bằng axit chiết (axit citric hoặc axit nitric). Trong môi trường pH axit, liên kết giữa các mạch polysaccarit trong vách tế bào bị phá vỡ, do đó, pectin được chiết ra dễ dàng hơn.
Pectin thu được có màu vàng nâu, là do trong thành phần mạch chính của pectin có các gốc đường rhamnozo nằm xen kẽ nhau, pectin còn chứa một lượng nhỏ D-galactozo, arabinozo… Do đó, khi thủy phân ở nhiệt độ cao, thành phần đường sẽ gây ra phản ứng caramen hóa.
33
Khóa luận tiến hành đun cùi bưởi với hai loại axit: axit nitric và axit citric cùng nồng độ trong một khoảng thời gian với nhiệt độ đun khuấy giống nhau. Hình ảnh pectin tách được (Hình 3.2)cho thấy mẫu pectin thu được từ axit citric (a) ở dạng bột mịn, trong khi mẫu pectin thu được từ axit nitric (b) sau nghiền ko ở dạng bột mịn được. Khi hòa hai mẫu pectin trong nước, mẫu a tan hoàn toàn tạo dung dịch keo, mẫu b không tan được mà chỉ trương lên một phần (Hình 3.3). Như vậy, có thể nhận thấy việc lựa chọn loại axit chiết pectin có ảnh hưởng lớn tới chất lượng sản phẩm pectin thu được. Thật vậy, việc sử dụng axit nitric (axit mạnh) có khả năng thủy phân các chuỗi poly galacturomic và các nhóm glycoside của pectin nhiều hơn, dẫn đến hiệu suất thu hồi giảm. Mặt khác, axit citric là dung môi hữu cơ an toàn, không gây độc. Do đó, axit citric được lựa chọn làm dung môi cho quá trình tách chiết pectin tiếp theo.
Hình 3.2: Pectin được tách bằng axit citric (a) và axit nitric (b)
34
Hình 3.3: Khả năng hòa tan của pectin tách bằng axit citric (a) và axit nitic (b)
3.3 Khảo sát hiệu suất tách pectin bằng axit citric
3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất tách pectin
Trong quá trình tách pectin, thời gian chiết là một trong các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chiết.
Pectin được khảo sát bằng axit citric ở nhiệt độ từ 70 - 80oC với pH = 2, đun khuấy từ trong thời gian từ 50 – 100 phút.
Hình 3.4 cho thấy khi thời gian đun khuấy axit tăng từ 50 đến 60 phút, hiệu suất tách pectin tăng đến 20,91 %. Tuy nhiên, khi thời gian đun khuấy axit tiếp tục tăng đến 100 phút, hiệu suất tách pectin giảm (còn 8,69 %). Thực vậy, khi thời gian chiết kéo dài, cấu trúc mạch pectin mềm ra, làm tăng hiệu quả của quá trình thủy phân, dẫn đến hiệu quả tách tăng. Nếu thời gian chiết quá ngắn, pectin trong nguyên