Tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu tập trung vào khả năng thu được tối đa chất phân tích ở dịch chiết cuối cùng, được thể hiện qua thông số độ thu hồi của chất phân tích. Để đạt mục đích trên, nghiên cứu tập trung tối ưu bốn thông số của quy trình gồm: dung môi chiết, quá trình bay hơi dung môi, loại chất hấp phụ được sử dụng ở bước làm sạch và thể tích dung môi rửa giải. Trong quá trình xử lý mẫu, có khả năng cao xuất hiện các chất được chiết
đồng thời với chất phân tích, tạo ra ảnh hưởng nền làm tăng hoặc giảm tín hiệu của OCPs ở hệ thống khối phổ. Để giảm thiểu ảnh hưởng nền đến kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu, độ thu hồi được tính theo hiệu suất phần trăm (%) giữa tín hiệu từ mẫu khảo sát trên tín hiệu mẫu chuẩn trên nền trắng. Mẫu khảo sát là mẫu được thêm chuẩn trước khi thực hiện quy trình xử lý mẫu theo thông số cần khảo sát. Mẫu chuẩn trên nền trắng là mẫu được pha từ
dung dịch chuẩn và dịch chiết của mẫu trắng gạo theo quy trình xử lý mẫu dự
kiến.
2.2.2.1. Dự kiến quy trình xử lý mẫu
Để giảm thiểu hiệu ứng nền và tăng hiệu quả chiết thay vì kết hợp chiết xuất QuEChERS và làm sạch d-SPE thông thường, tôi lựa chọn SPE cho
bước làm sạch dịch chiết. Dựa trên nghiên cứu xác định hóa chất BVTV trong chè của Lý Tuấn Kiệt và công sự [30], quy trình xử lý mẫu dự kiến xác định OCPs trên nền mẫu gạo như sau :
Bước 1. Cân 2 g mẫu gạo cho vào ống Falcon 50 mL.
Bước 2. Thêm 5ml nước deion và 10 mL ACN (1% axit axetic) và vào
ống Falcon 50 mL. Lắc vortex trong 1 phút và lắc 30 phút.
Thêm muối EN 15662 QuEChERS (1g NaCl, 4 g MgSO4, 1g Na3Citrate, 0,5g Na2HCitrate)
Lắc vortex trong 1 phút.
Bước 3. Lấy ống Falcon ly tâm trong 10 phút với tốc độ 4500
vòng/phút.
Bước 4. Hút 5 mL dung dịch (lớp dung môi phía trên) và cho đi qua cột được chiết pha rắn SPE để làm sạch
Bước 5. Rửa giải bằng 20ml ACN-Toluenen (3:1, v/v). Thu thập dung dịch chiết và dung dịch rửa giải
Bước 6. Ly tâm chân không dung dịch đến ~5 mL, sau đó làm khô dưới
dòng khí N2 ở nhiệt độ thấp. Hòa tan cắn trong 1 mL n-hexan rồi đem phân tích bằng GC-MS/MS.
Hình 2.2: Quy trình dự kiến xử lý mẫu phân tích OCPs
2.2.2.2. Lựa chọn dung môi chiết
Trong nghiên cứu này, mẫu được chiết theo phương pháp QuEChERS,
vì vậy dung môi acetonitrile (ACN) đã được chọn làm dung môi chiết do có nhiều ưu điểm hơn so với các dung môi diclometan, n-hexan…Thứ nhất, acetonitrile có thể trộn lẫn với nước nhưng lại có thể tách lớp với nước khi cho thêm các muối như MgSO4. Thứ hai, acetonitril hạn chế hòa tan nhiều tạp chất như lipit hoặc protein, chất béo nên dịch chiết sẽ ít chịu ảnh hưởng
của nền mẫu [30, 31]. Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc sử dụng axit axetic cải thiện đáng kể hiệu quả chiết xuất trong phân tích đa dư lượng
HCBVTV đồng thời việc bổ sung axit axetic vào MeCN giúp tăng cường tính
ổn định của một số loại hoá chất trừ sâu [32, 33]. Đồng thởi đối với nền mẫu
có hàm lượng nước như ngũ cốc cần được bổ sung nước đảm bảo hiệu quả
chiết [28]. Do đó, ba loại dung môi khác nhau được lựa chọn để đánh giá hiệu quả chiết xuất: (i) 10 mL ACN, (ii) 5 mL nước và 10 mL ACN và (iii) 5 mL
nước và 10 mL ACN (1% axit axetic).
2.2.2.3. Lựa chọn chất hấp phụ SPE
So với trái cây và rau quả, gạo đại diện cho nền khô với thành phần chính là tinh bột nhưng tỷ lệ nhỏ bao gồm các hợp chất như axit béo, lipid, xơ, khoáng chất và protein lại gây khó khăn cho việc phân tích sắc ký. Do đó,
việc sử dụng vật liệu hấp thụ một cách thích hợp trong giai đoạn làm sạch sẽ
giúp giảm thiểu hiệu ứng chất nền và kéo dài tuổi thọ của cột sắc ký.
Trong chiết xuất QuEChERS, các chất hấp phụ thường được sử dụng trong gồm: C18, PSA (Primary and secondary amine), GCB (graphite carbon black). PSA là một chất hấp phụtrao đổi anion yếu trên nền silicagel dùng để
hấp phụ các axit béo và cacbohydrat. C18 hấp phụ tốt đối với các chất không phân cực như chất béo, sáp, đừờng, tinh bột và không ảnh hưởng (hấp phụ) với phần lớn các HCBVTV. GCB được sử dụng để loại màu, chlorophyll và carotenoid. Tuy nhiên GCB lại có khả năng hấp phụ các hóa chất BVTV có cấu trúc phẳng như HCH [34, 35]. Trên cơ sở tính chất của các chất hấp phụ
kết hợp với tính chất của nền mẫu, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kết hợp hai chất hấp phụ là C18 và PSA.
2.2.2.4. Khảo sát quá trình bay hơi dung môi
Phương pháp thêm chuẩn được sử dụng để đánh giá hiệu quả thu hồi từ quá trình bay hơi dung môi. Dung dịch chuẩn hỗn hợp OCPs (50 μL, 1 mg/L) được thêm vào 25 mL (5 mL ACN chứa 1% AA và 20 mL ACN/toluen, 3/1, v/v). Làm bay hơi dung môi cho đến khi thể tích còn lại là 1ml (EC-A) hoặc
2.2.2.5. Ảnh hưởng nền mẫu
Hiệu ứng nền mẫu (làm tăng cường hoặc triệt tiêu tín hiệu phân tích) là yếu tố quan trọng hàng đầu ảnh hưởng đến độ lặp lại của phương pháp phân tích sắc ký khí ghép nối với khối phổ. Đánh giá ảnh hưởng nền (Matrix effect - ME) bằng phương pháp dựng hai đường chuẩn cho mỗi chất: mẫu chuẩn trên nền trắng và mẫu chuẩn trên dung môi, so sánh hệ số góc hai đường chuẩn để xem xét ảnh hưởng nền. ME được tính là chênh lệch của góc đường chuẩn pha trên nền mẫu so với đường chuẩn pha trên nền dung môi.
Theo SANTE 2019/12682 [29] ME ≤ 20% được xem là khoảng chấp nhận được và nền mẫu có ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả phân tích và
ngược lại, các giá trị ME nằm ngoài khoảng giới hạn này biểu thị sự ảnh
hưởng của hiệu ứng nền mẫu đến kết quả phân tích trên thiết bị phân tích MS